Immunohistochemie en immunocytochemie: weefselafbeeldingen via lichtmicroscopie

1. Voorbereiding van cellen voor immunocytochemie

1. Zaai cellen van belang op kamerslides of kamerdeksels door 0,5 mL celsuspensie toe te voegen aan de putjes van een 24-putjes kwekerijplaat.
   Opmerking: Sommige cellen vereisen mogelijk groei op behandelde deksels, zoals deksels behandeld met poly-lysine. Optimale behandelingsvoorwaarden moeten worden bepaald door de gebruiker, afhankelijk van het gebruikte celtype.
2. Plaats de plaat in een bevochtigde CO₂ incubator en laat de cellen groeien bij 37°C tot 50-70% confluent.
3. Zodra de cellen de optimale confluency bereiken, verwijder het kweekmedium uit elke put en fixeer vervolgens de cellen door ze 20 min op kamertemperatuur te incuberen in 0,5 mL 4% PFA (verdund in 1X PBS).
4. Verwijder het fixeermiddel en was de putjes drie keer met 1 mL 1X PBS.
5. Permeabiliseer vervolgens de cellen door 0,5 mL 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS toe te voegen aan elke put en 15 min op kamertemperatuur te incuberen.
6. Aspiseer het permeabiliseringsbuffer en was de putjes driemaal met 1 mL 1X PBS.
7. De cellen op deksels zijn nu gefixeerd en permeabiliseerd. Ga verder met de kleuringsprocedure die wordt gedemonstreerd voor het volgende immunohistologievoorbeeld, met uitzondering dat de incubaties moeten worden uitgevoerd in de putjes van de 24-putjesplaat in plaats van direct op een weefselsectieslide.

2. Voorbereiding van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde secties voor kleuring

1. Verkrijg voorbereide formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties.

Deparaffinisatie

2. Dompel de slides twee keer gedurende 5 min in 100% xyleen.

Rehydratie

3. Dompel de slides twee keer gedurende 3 min in 100% ethanol.
4. Dompel de slides 3 min in 95% ethanol.
5. Dompel de slides 3 min in 70% ethanol.
6. Dompel de slides 3 min in 50% ethanol.

Blokking van endogene Peroxidase Activiteit

7. Incubeer de slides in 100 mL 0,3% H₂O₂ gedurende 30 min op kamertemperatuur.
8. Was de slides twee keer gedurende 5 min met 1X PBS.

Antigeenretrieval

9. Dompel de slides in IHC citraatbuffer (pH 6) en kook ze gedurende 20 min.
10. De weefselslides zijn nu klaar voor kleuring.

3. Voorbereiding van vers-ingevroren, OTC-ingebedde secties voor kleuring

1. Plaats 5 mm vers geïsoleerd weefsel in een mal en voeg OCT toe totdat de sectie volledig bedekt is.
2. Dompel de weefselblok langzaam in vloeibare stikstof totdat deze volledig bevroren is. Het monster kan nu maximaal 1 jaar worden bewaard bij -80°C.
3. Zodra het klaar is voor sectie, breng de bevroren weefselblok over naar een cryostaat en laat de hele setup komen tot -20°C.
4. Snij 5-10 µm dikke weefselsecties met een cryostaat en gebruik een borstel om de secties direct op IHC-compatibel glas te plaatsen.
5. Laat de slides overnacht bij kamertemperatuur drogen. De slides kunnen ook worden bewaard bij -80°C.
6. Dompel de slides 15 min in 250 mL 4% PFA bij kamertemperatuur om de slides te fixeren vóór de kleuring. Optimale fixatiemethode moet worden bepaald door de gebruiker.
7. Dompel de slides twee keer gedurende 5 min in 250 mL 1X PBS.
8. Dompel de slides twee keer gedurende 5 min in 250 mL 0,3% H₂O₂ bij kamertemperatuur om elke endogene peroxidase-activiteit te blokkeren.
9. Dompel de slides twee keer gedurende 5 min in 250 mL 1X PBS.
10. De slides zijn nu klaar voor kleuring.

4. Kleuring

1. Cirkelt het weefsel met een hydrofobe barrière met behulp van een barrièrepen.

Blokking

2. Plaats met behulp van een pipet 100 µL blokkeringsbuffer (paardenserum verdund in 1X PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur boven de sectie.
3. Verwijder de blokkeringsbuffer met behulp van een pipet.

Incubatie met primaire antilichaam

4. Incubeer het omcirkte weefsel met 100 µL verdunde primaire antilichaamoplossing (muis anti-menselijk cyclin D1 verdund 1:100 in blokkeringsbuffer) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
5. Laat het primaire antilichaam van elke slide weglopen en was de slides twee keer gedurende 5 min met 1X PBS.

Incubatie met secundair antilichaam

6. Incubeer het monster met 100 µL verdund biotinyleerd secundair antilichaam (biotinyleerde paarden anti-muis IgG verdund 1:200) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
7. Verwijder het secundaire antilichaam door de secties weg te laten lopen en was met 1X PBS twee keer gedurende 5