Immunohistochemie en immunocytochemie: weefselafbeeldingen via lichtmicroscopie

Immunoccytochemie en immunohistologie zijn kleurmethoden voor een eiwit van belang in gekweekte cellen en weefsels, respectievelijk. Het basisprincipe van beide gerelateerde technieken omvat het gebruik van specifieke antilichamen die zijn gemarkeerd met een detectiesysteem om het eiwit te identificeren en te visualiseren en zijn locatie in de cellen en weefsels te bepalen, evenals de relatieve niveaus. Het proces in elk van de experimenten begint met monstervoorbereiding.

Voor immunocytochemie, die specifiek eiwit- of antigeenlocaties in cellen visualiseert, omvat dit drie stappen. De eerste stap is plateren, wat inhoudt dat de cellen in groeimedium op een dekglas of glijbaan worden gekweekt, meestal in de putjes van een kweekplaat. Dit wordt gevolgd door fixatie, waarbij een precipitatie- of verknopingsmiddel zoals paraformaldehyde aan de cellen wordt toegevoegd om de structurele integriteit van de eiwitten te behouden en enzymactiviteit te voorkomen die ze zou kunnen degraderen. De laatste stap is permeabilisatie, waarbij een oppervlakteactieve stof wordt toegevoegd om de celmembranen permeabel te maken voor de kleuring.

In de tegenhangermethode, immunohistologie, worden eiwitten of antigenen gevisualiseerd in weefsels en monstervoorbereiding heeft vijf stappen. Eerst wordt het hele weefsel onderworpen aan fixatie, meestal met paraformaldehyde. Dit wordt gevolgd door het insluiten van het weefsel in een blok paraffine, en vervolgens het snijden van dit blok met behulp van een machine genaamd een microtoom om het weefsel in dunne plakjes te snijden die op dia's kunnen worden geplaatst. Vervolgens worden de dia's onderworpen aan deparaffinisatie, of verwijdering van de paraffine rond de weefselsnede. Dan kan een optionele antigeenretrieval stap worden uitgevoerd. Dit kan worden gedaan met behulp van warmte of enzymen om epitopen te onthullen die tijdens fixatie waren verknoopt, waardoor ze beschikbaar worden gemaakt voor antilichaambinding. Na de juiste monstervoorbereiding wordt een doelwitspecifiek primair antilichaam toegevoegd aan het cel- of weefselmonster. Dit primaire antilichaam zou zich moeten binden aan het eiwit van belang. Vervolgens wordt een secundair antilichaam toegevoegd, dat het primaire antilichaam detecteert en bindt. Dit secundaire antilichaam is geconjugeerd met, of kan binden aan, een enzym genaamd HRP. Wanneer zijn specifiek substraat, DAB, wordt toegevoegd, zet HRP dit om in een onoplosbaar, bruin neerslag. Deze bruine kleurstof markeert de locatie van het doelwiteiwit. De dia's worden ook gekleurd met hematoxylinen, dat de kernen in blauw markeert en een ruimtelijk referentiepunt biedt voor het bepalen van subcellulaire lokalisatie. Daarna wordt montagemedium toegevoegd aan de dia, gevolgd door een dekglaasje om het gekleurde monster te verzegelen en te bewaren. Ten slotte kunnen de dia's worden geïmager op een lichtmicroscoop.

In deze video zult u de monstervoorbereidingstechniek voor geplateerde cellen en weefselsecties waarnemen, gevolgd door immunokleuring van de weefselsecties.

Eerst moeten de cellen van belang worden geplaatst op dekglaasjes. Om dit te doen, werk in een weefselcultuurkap, plaats individuele dekglaasjes in de putjes van een 24-putjesplaat. Sluit vervolgens de kap en zet het UV-licht aan om de dekglaasjes gedurende ten minste 15 minuten te steriliseren. Draai vervolgens het UV-licht uit. Om de cellen van belang uit een confluente 10-centimeter schotel op te tillen, aspireer het medium, was kort met PBS en voeg trypsine toe aan de cellen gedurende 2 minuten. Tik vervolgens op de zijkant van de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen zijn losgekoppeld en neutraliseer de trypsine met medium. Voeg vervolgens 0,5 ml van de celsuspensie toe aan elk putje, zorg ervoor dat de dekglaasjes bedekt zijn. Plaats de plaat in een gehumidificeerde CO2-incubator en laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius tot ze 50-70% confluent zijn.

Zodra de cellen de optimale confluency bereiken, aspireer het kweekmedium uit elk putje en fixeer vervolgens de cellen door ze 20 minuten in 0,5 ml 4% paraformaldehyde te incuberen, verdund in 1X PBS bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het fixeermiddel, spoel de cellen door 1 ml 1X PBS toe te voegen over elk dekglaasje. Aspireer onmiddellijk het PBS en herhaal de spoeling nog 2 keer voor een totaal van 3 wasbeurten.

Permeabiliseer nu de cellen door 0,5 ml van 0,1% Triton X-100 in 1X PBS toe te voegen aan elk putje. Laat de plaat 15 minuten bij kamertemperatuur staan. Aspireer de permeabilisatiebuffer af en spoel vervolgens de cellen door 1 ml 1X PBS toe te voegen aan elk putje. Aspireer onmiddellijk het PBS af en herhaal de spoeling nog 2 keer voor een totaal van 3 wasbeurten. Nu de cellen op de dekglaasjes zijn gefixeerd en permeabiliseerd, gaat u verder met de kleuringsprocedure die wordt gedemonstreerd voor het volgende immunohistologievoorbeeld, met uitzondering van het feit dat de incubaties in de putjes van de 24-putjesplaat moeten worden uitgevoerd in plaats van direct op een weefselsectie-schuif.

Om te beginnen, verkrijg voorbereide, formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefselsecties. Deparaffiniseer de dia's door ze in een schuifrek te plaatsen en vervolgens volledig onder te dompelen in 250 ml 100% xyleen. Laat de dia's 5 minuten in het xyleen incuberen. Verwijder vervolgens de dia's uit de container, veeg ze af met een papieren handdoek en plaats ze in een nieuwe xyleenbad in een verse container voor nog eens 5 minuten.

Volgend, rehydreer de secties in een reeks gegradueerde ethanoloplossingen, beginnend met 100% ethanol gedurende 3 minuten. Veeg de schuifrek af met een papieren handdoek en breng de dia's over naar een nieuwe container met 100% ethanol voor nog eens 3 minuten. Ga door met deze cyclus van wassen, drogen met een papieren handdoek en overbrengen van de dia's naar een nieuw bad volgens de aangegeven concentraties van ethanol