Why can't B-cells be cultured directly to produce monoclonal antibodies?

B-cells do not survive well in long-term culture, making it impossible to maintain them indefinitely for antibody production. To overcome this limitation, scientists fuse B-cells with immortal myeloma cells to create hybridomas, which combine the antibody-producing properties of B-cells with the indefinite growth capacity of myeloma cells.

What is the difference between polyclonal and monoclonal antibodies?

Polyclonal antibodies are a mixture of antibodies, each recognizing different epitopes on an antigen, produced by multiple B-cell clones. Monoclonal antibodies are identical antibodies produced by a single hybridoma cell line, recognizing only one specific epitope. This makes monoclonal antibodies more specific and useful for distinguishing between similar antigens.

How does limiting dilution ensure monoclonal antibody production?

Limiting dilution is a serial dilution process that statistically ensures single cells are seeded into screening plate wells. Wells containing one cell grow into monoclonal populations producing identical antibodies. This cloning method guarantees that the resulting hybridoma line releases only the desired antibody of known specificity.

What role does ammonium sulfate play in antibody purification?

Ammonium sulfate precipitation removes antibodies from culture medium by competing with proteins for water molecules through hydrophilic interactions. The highly charged ammonium and sulfate ions decrease antibody solubility, causing them to precipitate out of solution. This salting-out method is a standard technique for protein purification from culture supernatants.

Why is dialysis tubing used after ammonium sulfate precipitation?

Dialysis tubing removes residual ammonium sulfate from the antibody solution through osmotic exchange. The antibody solution is placed in dialysis tubing and immersed in PBS buffer overnight. Water and small salt ions pass through the tubing membrane while antibodies remain inside, resulting in purified antibody free of ammonium sulfate.

How is antibody concentration determined after purification?

Antibody concentration is measured using a spectrophotometer at 280 nanometers, which detects protein absorbance. A 20-fold dilution of the antibody sample is prepared in PBS, then analyzed using the spectrophotometer. The concentration is calculated using a standard formula and recorded for documentation and storage of the purified monoclonal antibody.

What screening method is used to identify hybridomas producing the desired antibody?

ELISA assays indirect sandwich and competitive methods are used to screen hybridoma culture media for the presence of the target antibody. After hybridoma fusion and limiting dilution cloning, ELISA detects which wells contain cells producing the desired monoclonal antibody. This screening step ensures only hybridomas with the correct antibody specificity are selected for expansion and antibody production.

Antilichaamgeneratie: Productie van monoklonale antilichamen met behulp van hybridomen

0 weergaven13:21 min

Opmerking: Er moet een steriele celkweektechniek worden aangehouden bij het hanteren van de hybridoma-cellen en het medium op een steriele manier (bijv. in een bioveiligheidskastje) tot aan de stappen voor het zuiveren van het antilichaam.

1. Ontdooien van bevroren hybridoma-cellen

Incubeer het buisje met de bevroren hybridoma-cellen in een waterbad van 37°C tot het net ontdooid is (ongeveer 2 minuten).
Voeg de ontdooide cellen toe aan een conische buis van 15 mL met 10 mL compleet RPMI (RPMI aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 1mM natriumpyruvaat, 1x niet-essentiële aminozuren, 50 µM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
Centrifugeer gedurende 5 min bij 1200 RPM om eventueel verontreinigd bevriezingsmedium weg te spoelen.
Na centrifugatie, gooi de vloeibare supernatant weg en suspendeer het cellenpellet in 5 mL vers compleet RPMI. Voeg vervolgens de cellen toe aan een T75 weefselkweekfles met 15 mL compleet RPMI (het eindvolume van RPMI is 20 mL).
Laat de cellen groeien in een standaard incubator bij 37°C met 5% CO₂. Cellen zijn niet-adhesief tijdens de kweek.

2. Hybridoma-expansie

Laat de cellen ongeveer 3 dagen groeien tot de flacon ~80% confluënt is.
Opmerking: Deze hoeveelheid tijd kan variëren op basis van het startaantal cellen, evenals inherente verschillen in groeisnelheden van verschillende cellen. Het is belangrijk dat de cellen in de exponentiële groeifase zijn.
Zodra de initiële flacon ~80% confluëntie bereikt, verwijder de cellen uit deze initiële T75-flasco, plaats in een conische centrifugeerbuis en centrifugeer (1200 RPM gedurende 5 min) om de cellen te pellen.
Suspendeer de cellen in 6 mL compleet RPMI, en verdeel vervolgens de cellensuspensie in drie nieuwe T75-flacons (2 mL/flasco bevattend 18 mL RPMI). Incubeer deze drie T75-flacons bij 37°C met 5% CO₂ tot ze ~80% confluënt zijn (dit zou ongeveer 3 dagen moeten duren).

3. Antilichaamproductie in serumvrij medium

Opmerking: Op dit punt zijn de cellen klaar om hun groei voort te zetten in een serumvrij medium dat is ontworpen voor de groei van hybridoma-cellijnen. In dit protocol gebruiken we het kant-en-klare, commercieel verkrijgbare HB Basal Liquid-medium dat het HB101 Supplement Product bevat.

De cellen uit elk van de drie T75-flacons (bij ~80% confluëntie) worden verzameld en gecentrifugeerd (1200 RPM gedurende 5 min).
Het cellenpellet uit elke T75-flasco wordt gesuspendeerd in 10 mL gesupplementeerd HB101 serumvrij medium en vervolgens toegevoegd aan twee T225-flacons met gesupplementeerd HB101 serumvrij medium (dwz. 5 mL cellensuspensie in elk van de 6 flacons bevattend ~220-240 mL HB101 in elke flasco).
Blijf de cellen kweken in T225-flacons en HB101-medium bij 37°C met 5% CO₂ gedurende drie weken, of tot de cellen beginnen af te sterven. De cellen produceren mAb gedurende deze 3 weken en scheiden het af in het kweekmedium. Zodra de cellen beginnen af te sterven, produceren ze geen mAb meer.

4. Antilichaamzuivering - Dag 1

Opmerking: Op dit punt hoeft steriliteit niet te worden gehandhaafd, dus het hanteren van het medium op een steriele manier (bijv. in een bioveiligheidskastje) is niet vereist. Bovendien worden hybridomen niet beschouwd als een "BSL2 niveau" agent.

Giet media uit de flacons in buisjes voor een vaste hoek rotor. Centrifugeer de buisjes in een centrifuge met een vaste hoek rotor bij 10.000 RPM gedurende 8 minuten. Deze stap is ontworpen om het cellulaire puin uit het cultuursupernatant te verwijderen.
Opmerking: De buisjes kunnen variëren in grootte afhankelijk van de gebruikte rotor. Het belangrijkste om te onthouden is dat de volumes in de buisjes hetzelfde moeten zijn om ervoor te zorgen dat de rotor goed gebalanceerd is vóór centrifugatie. Het is waarschijnlijk dat het volledige volume van het medium niet in de centrifuge past. Het resterende medium wordt later gecentrifugeerd (stap 4.5) met behulp van dezelfde buisjes.
Bereid een 2L plastic beker met een roerstaaf in een emmer omgeven door ijs voor. Plaats op een roerplaat.
Bevestig een 500 mL filtertop op een 1L fles. Bevestig de flesdeksel filtereenheid aan huisvacuüm via geschikte buis.
Giet het supernatant van stap 4.1 (dat nog steeds het mAb bevat dat door de hybridoma-cellen is geproduceerd) in de filtertop.
Gebruik dezelfde set buisjes om cellulaire puinhopen uit het medium te pellen (het pellet zal blijven opbouwen). Wacht met het gebruik van de vacuüm totdat de filtertop vol is en er nog een batch supernatant klaar is om in te gieten. Laat de filter niet uitdrogen, anders wordt het filteren erg traag.
Wanneer de 1L fles bijna vol is, verwijder de filtertop en giet supernatant in 2L beker bereid in stap 4.2. Bevestig de filtertop opnieuw. Houd het volume bij.
Herhaal de centrifugatie- en filtratiestappen totdat al het medium is verwerkt.
Meet 295g ammoniumsulfaat per 1L gefilterd supernatant uit. Voeg terwij

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bron: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3 en Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Afdeling Microbiologie, Immunologie en Kankerbiologie, Universiteit va…