Immunofluorescence Microscopie: Immunofluorescence Kleuring van in Paraffine Ingebedde Weefselsecties

1. Set-up

1. Het typische kleuringsprotocol omvat de volgende stappen:
   1. Re-hydratie van de weefselsecties op de slides met behulp van een reeks gegradeerde ethanols.
   2. Incubatie van de weefselsecties met een blokkeringsbuffer, die helpt om niet-specifieke binding van antilichaam aan het weefsel te blokkeren en achtergrondfluorescentie te verminderen.
   3. Verwijdering van de blokkeringsbuffer en incubatie van de sectie in primair antilichaam, waarbij het antilichaam zich op zijn peptidedoelwit zal binden.
   4. Verwijdering van het primaire antilichaam en uitgebreide wassing van de secties in wasbuffer.
   5. Incubatie van de secties met secundair antilichaam om binding aan primair antilichaam mogelijk te maken, als het primaire antilichaam niet direct is gelabeld met een fluorfoor en een secundair antilichaam vereist is.
   6. Wassing van het secundaire antilichaam van de slides.
   7. Monteren van de slides in montagemedium en laten drogen voorafgaand aan visualisatie op een fluorescentiemicroscoop.
2. De volgende items zijn nodig: slide holders (glas of plastic), potten, pipetten, pap pen, vochtige kamer, dekglasjes en montagemedium met DAPI.
3. Xyleen wordt gebruikt voor de rehydratie van slides. Xyleen is gevaarlijk en moet worden gebruikt in een afzuigkast samen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen en een laboratoriumjas.
4. Recepten voor buffers, oplossingen en reagentia
   1. Gegradeerde ethanols
      Ethanol - 160 mL 200 proof EtOH en 40mL ddH₂O
      Ethanol - 140 mL 200 proof EtOH en 60mL ddH₂O
   2. Antigeenretrieval oplossing
      10 mM natriumcitraat, pH 6,0
   3. Blokbuffer
      100 µL Serum van het gastheerdier waarvan het secundaire antilichaam is gemaakt
      900 µL 1X PBS
      Opmerking: Dit is het volume voor 10 secties; pas het volume aan voor ongeveer 100 µL buffer per sectie, indien nodig.
   4. Wasbuffer (1X PBS)

2. Protocol

1. Rehydratie met xyleen en ethanols
   1. Plaats de slides in een slide holder en dompel de slides vervolgens onder in de 100% Xylene isomeren oplossing, ervoor zorgen dat de slides volledig bedekt zijn met oplossing.
   2. Incubeer de slides in de 100% Xylene isomeren gedurende 3 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 3 afzonderlijke incubaties. Zorg ervoor om de slide rack met een papieren handdoek af te vegen voordat u overschakelt naar een nieuwe oplossing om besmetting te minimaliseren.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen dat deze incubaties in drie afzonderlijke containers worden uitgevoerd.
   3. Incubeer de slides in 100% EtOH gedurende 2 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 3 afzonderlijke incubaties.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen dat deze incubaties in drie afzonderlijke containers worden uitgevoerd.
   4. Incubeer de slides in 95% EtOH gedurende 2 minuten.
   5. Incubeer de slides in 80% EtOH gedurende 2 minuten.
   6. Incubeer de slides in 70% EtOH gedurende 2 minuten.
   7. Incubeer de slides in 1X PBS gedurende 5 minuten.
2. (Optioneel) Antigeenretrieval om epitopen te onthullen die worden herkend door het primaire antilichaam
   Opmerking 1: Deze procedure is sterk afhankelijk van het gebruikte antilichaam en het wordt aanbevolen om initiële optimalisatieprocedures uit te voeren om de vereiste voor antigeenretrieval te bepalen.
   Opmerking 2: Deze procedure is niet uitgevoerd met de F4/80 kleuring die hieronder wordt getoond. De vereiste voor antigeenretrieval moet worden geoptimaliseerd voor elk nieuw antilichaam.
   1. Plaats de slides in een hittebestendige plastic of glazen slide holder en zorg ervoor dat de rack gevuld is met slides om een gelijkmatige warmteverdeling te garanderen. Lege slides kunnen worden gebruikt als er minder monsters zijn dan sleuven in de rack.
   2. Plaats de rack in 1000 mL antigeen onthullende oplossing in 2L beker - 10 mL antigeen onthullende stock op 990mL water.
   3. Microwaven op hoog gedurende 20 minuten in totaal, zorg ervoor dat de slides bedekt blijven met water.
   4. Laat de slides gedurende 20 minuten afkoelen in de beker.
   5. Was de slide rack in slide holders met ddH₂O gedurende 5 minuten elk. Herhaal twee keer voor een totaal van 3 afzonderlijke incubaties met vers ddH₂O elke keer. De slides kunnen tijdens elke wassing in dezelfde slide holder worden gewassen.
   6. Incubeer de slides gedurende 5 minuten in 1X PBS.
3. Omcirkel de secties met een pap pen. Dit zal het gebruik van een minimale hoeveelheid buffer toestaan die nodig is om de weefselsecties te bedekken. Laat de weefselsecties niet uitdrogen.
4. Voeg blokbuffer toe aan elke sectie. De hoeveelheid buffer die nodig is om de sectie te bedekken, varieert afhankelijk van de grootte van de sectie, maar kan variëren van 25-500 µL. Er moet genoeg buffer worden gebruikt om een parel te vormen die het hele sectieoppervlak bedekt, inclusief de randen.
   Opmerking: De keuze van blokbuffer kan variëren afhankelijk van het gebruikte antilichaam. Bijvoorbeeld, 10% serum van het gastheerdier waarin het secundaire antilichaam is gekweekt, kan worden gebruikt om niet-specifieke binding van