Op immunoprecipitatie gebaseerde technieken: zuivering van endogene eiwitten met behulp van agarosekralen

1. Immunoprecipitatie met behulp van Protein A/G PLUS Agarose Beads

Bereiding van cel-lysaat

1. Centrifugeer 10⁸ thymocyten in een microcentrifuge bij 13.000 rpm gedurende 3 min en verwijder het supernatant.
   Opmerking: Het aantal cellen zal variëren afhankelijk van de expressieniveaus van het gewenste eiwit en het gekozen celtype.
2. Re-suspendeer de cellen in 500 µL lysis buffer RIPA met PMSF.
3. Verstoor de cellen met een paar snelle pulsen met een vortex en aspibeer vervolgens het lysaat een paar keer met een 25 G naald verbonden aan een spuit.
   Opmerking: Vermijd het maken van bellen. Gebruik een grotere naald zoals een 21G naald voor grotere celtypen.
4. Incubeer het cellysaat op ijs gedurende 10 min.
5. Centrifugeer het lysaat bij 13.000 rpm gedurende 15 min bij 4°C.
6. Transfer het supernatant naar een verse, gelabelde microcentrifugebuis.

Pre-clearing

7. Voeg 20 µL Protein A/G PLUS agarose beads en 1 µg van een isotype control antilichaam (hier wordt een muis IgG1 isotype control antilichaam gebruikt) toe aan het lysaat.
   Opmerking: De keuze van het isotype antilichaam hangt af van het specifieke antilichaam voor het eiwit dat later in de pull-down stap wordt gebruikt.
8. Incubeer de lysaatmix op een centrifuge rotator in de koude kamer (4°C) gedurende 30 min.
9. Centrifugeer het monster bij 3200 rpm gedurende 30 s bij 4°C.
10. Transfer het voorbehandelde supernatant naar een verse, gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuis. Gooi de pellet weg.

Bepaling van de eiwitconcentratie

11. Bepaal de eiwitconcentratie van het cellysaat door een Bradford Assay uit te voeren.
12. Pipetteer 1000 µL Bradford Reagens in 7 microcentrifugebuizen.
13. Voeg de volgende hoeveelheden BSA eiwit standaard (2 mg/mL) toe aan 6 van de buizen (Tabel 1).

Buisnummer	BSA Volume (μL) (2 mg/mL)	Eiwitconcentratie (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabel 1: BSA eiwit standaard hoeveelheden

14. Voeg in de 7^de buis 1 µL van het voorbehandelde lysaat toe.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de monsterconcentratie binnen het bereik van de assay ligt, bereid en analyseer ook een 1:2 of 1:5 lysaatverdunning.
15. Plaats 200 µL van elk van de 7 buizen in individuele wells van een vlakbodem 96-well plate, herhaal elke monster in drievoud.
16. Lees de plate op een plate reader bij 595 nm.
17. Genereer de standaardcurve in excel en bereken de eiwitconcentratie van het voorbehandelde lysaat.

Pull down

18. Label twee verse 1,5 mL microcentrifugebuizen - één als 'controle' en de andere als 'test', in dit voorbeeld is dit c-myc.
19. Plaats 500 µg voorbehandeld lysaat in elk van deze buizen.
    Opmerking: De hoeveelheid eiwit die hier wordt gebruikt, hangt af van de hoeveelheid eiwit die gezuiverd moet worden.
20. Breng het totaal volume voor elke buis op tot 500 µL met lysis buffer.
21. Voeg 2 µg anti-c-myc antilichaam toe aan de testgroepbuis en 2 µg muis IgG1 isotype control antilichaam aan de controlegroep.
    Opmerking: De hoeveelheid antilichaam hangt af van de effectiviteit van het antilichaam en de hoeveelheid van het doeleiwit.
22. Incubeer de buizen op een rotator in de koude kamer (4°C) gedurende 2 uur.
23. Voeg 20 µL Protein A/G PLUS agarose beads toe aan elke buis.
    Opmerking: Het is raadzaam om pipettenpunten met de punt afgesneden te gebruiken om schade aan de beads te voorkomen.
24. Incubeer op een rotator in de koude kamer (4°C) overnacht.
    Opmerking: Afhankelijk van het doeleiwit en de effectiviteit van het antilichaam, kan deze stap variëren van 1 uur tot overnacht.
25. Centrifugeer de buizen bij 3200 rpm gedurende 30 s bij 4°C om de beads neer te laten slaan.
26. Aspibeer het supernatant uit elke buis.
    Opmerking: Het doeleiwit is nu gebonden aan de beads.
27. Was de beads twee keer