Adoptieve celoverdracht: Introductie van donormuis-splenocyten naar een gastheermuis en evaluatie van het succes via FACS
Bron: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unit for Lymphopoiesis, Department of Immunology, Pasteur Insti…
1. Voorbereiding
- Voordat u begint, trek laboratoriumhandschoenen en de juiste beschermende kleding aan.
- Steriliseer alle dissectie-instrumenten, eerst met een reinigingsmiddel en vervolgens met 70% ethanol en droog ze daarna grondig.
- Bereid 50 mL Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBSS) voor met 2% foetaal runder serum (FCS).
2. Dissectie
- Euthaniseer de muis door middel van een kooldioxide-toevoersysteem door middel van hypoxie. Zet de euthaniseerde muis in de rugligging op een dissectieplaat vast en voer een longitudinale laparotomie uit met behulp van een schaar en pincet.
- Gebruik pincet om de darmen en de maag naar de rechterkant van de buik te verplaatsen om de maag en de milt bloot te leggen. De milt is aan de maag bevestigd.
- Gebruik pincet om de milt voorzichtig los te maken van de maag en plaats deze op een petrischaal met 5 ml HBSS 2% FCS.
3. Immuuncelisolatie
- Plaats de milt op een celzeef van 40 µm boven de petrischaal. Plet de milt met een plunjer om het los te maken.
- Herstel de aanwezige cellen door de plunjer en de zeef te spoelen met 1 ml HBSS 2% FCS.
- Breng de losgemaakte milt en de vloeistof over in een centrifugebuis van 15 ml.
- Was de petrischaal met 5 milliliter HBSS 2% FCS en breng de vloeistof over in de 15 ml buis.
- Centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi het supernatant weg, zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet in 2 ml kaliumammoniumchloride en pipet omhoog en omlaag om de pellet te resuspenderen en de erytrocyten te lyseren.
- Wacht 2 min en voeg HBSS 2% FCS toe aan de gesuspendeerde pellet om het volume op 14 ml te brengen.
- Centrifugeer de buis opnieuw bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 5 ml HBSS 2% FCS door omhoog en omlaag te pipetten.
- Tel de cellen met behulp van een trypaanblauwkleuringstest en pas de uiteindelijke celconcentratie aan tot 107 cellen/ml met behulp van een geschikt volume HBSS 2% FCS.
4. Adoptieve overdracht
- Breng 2 ml celsuspensie over in een verzamelbuis van 5 ml.
- Centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi vervolgens het supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 2 ml PBS en centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C.
- Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 200 µl PBS.
- Injecteer met een 0,5 ml-sering met een 29G-naald 200 µl celsuspensie intraveneus in de retro-orbitale bloedsinus van de experimentele muis.
- Injecteer als controle een tweede muis in dezelfde bloedsinus met 200 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing.
5. Celoogst en kleuring
- Vier dagen na de adoptieve overdracht, euthaniseer de muizen en verwijder de milt.
- Oogst de splenocyten zoals beschreven in sectie 3.
- Breng 100 µl celsuspensie van elke muis over in twee FACS-buisjes, gelabeld 'controle' en 'overgebracht'.
- Centrifugeer de buisjes bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi vervolgens de supernatanten weg.
- Bereid een mix voor met de vier antilichamen in de verdunningsconcentraties die in Tabel 1 zijn vermeld.
| Antilichamen | Fluorochrome | Verdunning |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
Tabel 1: Samenstelling van antilichamenmix. Bereiding van vier antilichaamcocktails met behulp van geconcentreerde antilichaam-fluorescerende conjugaten en HBSS.
- Voeg 100 µl van de mix toe aan elke buis en incubeer vervolgens gedurende 20 min op ijs in het donker.
- Voeg 1 ml HBSS 2%FCS toe en centrifugeer vervolgens de buisjes bij 370 x g gedurende 3 min bij 10°C.
- Gooi de supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 µl HBSS 2% FCS.
- Breng de gesuspendeerde cellen over in nieuwe, gelabelde FACS-buisjes.
- Evalueer met behulp van flowcytometrie, zoals weergegeven in het FACS-protocol, de aanwezigheid van CD45.2-positieve lymfocyten.
6. Gegevensanalyse
- Open de FlowJo software en sleep de bestanden voor elke buis in het Alle monsters venster.
- Dubbelklik op het overgebracht bestand om de cellen weer te geven die van dat monster zijn opgenomen op een stipplot die voorwaartse verspreid
Adoptief celtransfer is een methode om cellen van belang in een organisme te introduceren. Het is een krachtige techniek om verschillende biologische mechanismen te bestuderen, inclusief de werking van specifieke klassen van immuuncellen. Bovendien is adoptief transfer een veelbelovende nieuwe behandeling voor tal van aandoeningen, zoals die welke beenmergtransplantaties vereisen of kankerbehandelingen waarbij de eigen T-cellen van een patiënt kunnen worden geëxtraheerd, gewijzigd om kankercellen te herkennen en te vernietigen, en vervolgens worden teruggegeven aan het lichaam om tumoren te bestrijden.
In het laboratorium worden vaak diermodellen gebruikt om adoptief transfer te bestuderen. Bijvoorbeeld, CD45.1 Rag gamma-c knock-out muizen missen fundamentele receptoren voor veel cytokinen, die essentieel zijn voor de normale differentiatie van hematopoëtische stamcellen in lymfocyten. Als gevolg hiervan hebben de knock-out muizen een aangetast lymfocyt ontwikkeling en hebben ze geen natuurlijke killer-, of NK-, cellen, T-cellen of B-cellen.
Adoptief transfer kan worden gebruikt om de ontbrekende immuuncellen in deze aangetaste muizen te introduceren, door eerst donormuisweefsel te oogsten dat hoge concentraties immuuncellen bevat, zoals de milt. Het weefsel wordt vervolgens gedissocieerd en een verscheidenheid aan miltcellen, inclusief de immuuncellen, worden geïsoleerd. Vervolgens kunnen ongewenste erythrocyten, of rode bloedcellen, worden gelyseerd via de toevoeging van ammoniumchloride-kalium-lyseringsbuffer en de resterende witte bloedcellen, of splenocyten, worden vervolgens gescheiden van het celdebris met behulp van centrifugatie.
Ten slotte worden de gezuiverde splenocyten geïnjecteerd in de immuungecompromitteerde muizen, waardoor gedetailleerde studies van de functies van deze cellen mogelijk zijn. Enkele dagen later kan het succes van de adoptieve immuunceltransfer worden bevestigd door eerst de gastheer-splenocyten op dezelfde manier als het donorweefsel te isoleren en voor te bereiden. Vervolgens worden deze cellen gekleurd met gelabelde antilichamen tegen de donor-immuuncelmarkers, zodat ze kunnen worden geverifieerd en gesorteerd met behulp van FACS.
Om te beginnen, zet laboratoriumhandschoenen en de juiste beschermingsmiddelen aan. Was vervolgens een paar pincetten en dissectiescharen eerst met een detergent en vervolgens met 70% ethanol en droog ze vervolgens af met een schone papieren handdoek. Bereid 50 milliliter Hank's Balanced Salt Solution, of HBSS, met 2% Fetal Calf Serum, of FCS, door één milliliter FCS te combineren met 49 milliliter HBSS in een 50 milliliter tube. Meng door de oplossing ongeveer 10 keer zachtjes op en neer te pipetteren.
Dissecteer de geëuthaniseerde muis en verwijder zijn milt zoals gedemonstreerd in het JoVE videoprotocol FACS-technologie voor separaat van splische B-lymfocyten. Om immuuncellen te isoleren, plaats de milt eerst op een 40 micrometer celstrainer in een petrischaal. Verpletter de milt met een plunjer om het in de schaal te dissociëren. Herstel de aangehechtte cellen door de plunjer en de strainer te spoelen met 1 milliliter HBSS 2% FCS. Pipet vervolgens het gedissocieerde milt en vloeistof vanuit de petrischaal in een 50 milliliter centrifugeerbuis. Was de petrischaal met 5 milliliter HBSS 2% FCS en breng het vocht over naar de 15 milliliter buis.
Centrifugeer de buis 370 keer g gedurende zeven minuten bij 10 graden Celsius en haal vervolgens de buis voorzichtig eruit om de pellet niet te verstoren. Verwijder nu het supernatant zonder de pellet te verstoren en gooi het vocht weg in een geschikte afvalcontainer. Voeg vervolgens twee milliliter ammoniumchloride-kalium-lysingsbuffer toe aan de centrifugeerbuis en pipetteer op en neer om de pellet te resuspenderen en de erytrocyten te lyseren. Wacht twee minuten en voeg vervolgens HBSS 2% FCS toe aan de gesuspendeerde pellet om een totaalwaarde van 14 milliliter te verkrijgen. Herhaal de centrifugatie. Haal de buis voorzichtig eruit en gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de pellet in 5 milliliter HBSS 2% FCS door op en neer te pipetteren. Tel vervolgens de cellen in suspensie. Voeg vijf microliter trypanblauw toe aan vijf microliter celsuspensie en meng goed door op en neer te pipetteren. Deponeer vervolgens voorzichtig een vijf microliter druppel verdunde celsuspensie tussen het dekglas en de Malassez-glijmiddel. Met de microscoop ingesteld op 40X vergroting, tel het aantal cellen. Pas de celconcentratie aan tot 10 tot de zeven cellen per milliliter door het juiste volume HBSS 2% FCS toe te voegen.
Om het adoptieve transfer te beginnen, breng twee milliliter van de celsuspensie over naar een vijf milliliter opvangbuis. Centrifugeer de buis 370 keer g gedurende zeven minuten bij 10 graden Celsius en gooi vervolgens het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de pellet in twee milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing en centrifugeer de buis 370 keer g gedurende zeven minuten bij 10 graden Celsius. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de pellet in 200 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing. Injecteer met behulp van een 0,5 milliliter spuit met een 29-gauge naald 200 microliter celsuspensie intraveneus in de retro-orbitale bloedsinus van de experimentele muis.
Vier dagen na het adoptieve transfer, euthanaseren de muizen en verwijder de milten. Verzamel vervolgens de immuuncellen zoals beschreven in sectie drie. Transfer vervolgens 100 microliter celsuspensie van elke muis in twee FACS-buizen gelabeld controle en overgedragen. Centrifugeer de buizen 370 keer g gedurende zeven minuten bij 10 graden Celsius en gooi vervolgens de supernatanten weg. Bereid nu een mix voor die de vier antilichamen bevat bij de verdunning vermeld in tabel één. Voeg 100 microliter van de mix toe aan elke buis en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten op ijs in het donker. Voeg vervolgens een milliliter HBSS 2% FCS toe aan elke buis en centrifugeer vervolgens de buizen 370 keer g gedurende drie minuten bij 10 graden Celsius. Gooi de supernatanten weg en resuspendeer vervolgens de pellets in 200 microliter HBSS 2% FCS. Breng de gesuspendeerde cellen over naar nieuwe gelabelde FACS-buizen. Gebruik nu flowcytometrie zo
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.