Adoptieve celoverdracht: Introductie van donormuis-splenocyten naar een gastheermuis en evaluatie van het succes via FACS

1. Voorbereiding

1. Voordat u begint, trek laboratoriumhandschoenen en de juiste beschermende kleding aan.
2. Steriliseer alle dissectie-instrumenten, eerst met een reinigingsmiddel en vervolgens met 70% ethanol en droog ze daarna grondig.
3. Bereid 50 mL Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBSS) voor met 2% foetaal runder serum (FCS).

2. Dissectie

1. Euthaniseer de muis door middel van een kooldioxide-toevoersysteem door middel van hypoxie. Zet de euthaniseerde muis in de rugligging op een dissectieplaat vast en voer een longitudinale laparotomie uit met behulp van een schaar en pincet.
2. Gebruik pincet om de darmen en de maag naar de rechterkant van de buik te verplaatsen om de maag en de milt bloot te leggen. De milt is aan de maag bevestigd.
3. Gebruik pincet om de milt voorzichtig los te maken van de maag en plaats deze op een petrischaal met 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Immuuncelisolatie

1. Plaats de milt op een celzeef van 40 µm boven de petrischaal. Plet de milt met een plunjer om het los te maken.
2. Herstel de aanwezige cellen door de plunjer en de zeef te spoelen met 1 ml HBSS 2% FCS.
3. Breng de losgemaakte milt en de vloeistof over in een centrifugebuis van 15 ml.
4. Was de petrischaal met 5 milliliter HBSS 2% FCS en breng de vloeistof over in de 15 ml buis.
5. Centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi het supernatant weg, zonder de pellet te verstoren.
6. Resuspendeer de pellet in 2 ml kaliumammoniumchloride en pipet omhoog en omlaag om de pellet te resuspenderen en de erytrocyten te lyseren.
7. Wacht 2 min en voeg HBSS 2% FCS toe aan de gesuspendeerde pellet om het volume op 14 ml te brengen.
8. Centrifugeer de buis opnieuw bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 5 ml HBSS 2% FCS door omhoog en omlaag te pipetten.
9. Tel de cellen met behulp van een trypaanblauwkleuringstest en pas de uiteindelijke celconcentratie aan tot 10⁷ cellen/ml met behulp van een geschikt volume HBSS 2% FCS.

4. Adoptieve overdracht

1. Breng 2 ml celsuspensie over in een verzamelbuis van 5 ml.
2. Centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi vervolgens het supernatant weg.
3. Resuspendeer de pellet in 2 ml PBS en centrifugeer de buis bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C.
4. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 200 µl PBS.
5. Injecteer met een 0,5 ml-sering met een 29G-naald 200 µl celsuspensie intraveneus in de retro-orbitale bloedsinus van de experimentele muis.
6. Injecteer als controle een tweede muis in dezelfde bloedsinus met 200 µl fosfaatgebufferde zoutoplossing.

5. Celoogst en kleuring

1. Vier dagen na de adoptieve overdracht, euthaniseer de muizen en verwijder de milt.
2. Oogst de splenocyten zoals beschreven in sectie 3.
3. Breng 100 µl celsuspensie van elke muis over in twee FACS-buisjes, gelabeld 'controle' en 'overgebracht'.
4. Centrifugeer de buisjes bij 370 x g gedurende 7 min bij 10°C en gooi vervolgens de supernatanten weg.
5. Bereid een mix voor met de vier antilichamen in de verdunningsconcentraties die in Tabel 1 zijn vermeld.

Antilichamen	Fluorochrome	Verdunning
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Tabel 1: Samenstelling van antilichamenmix. Bereiding van vier antilichaamcocktails met behulp van geconcentreerde antilichaam-fluorescerende conjugaten en HBSS.

6. Voeg 100 µl van de mix toe aan elke buis en incubeer vervolgens gedurende 20 min op ijs in het donker.
7. Voeg 1 ml HBSS 2%FCS toe en centrifugeer vervolgens de buisjes bij 370 x g gedurende 3 min bij 10°C.
8. Gooi de supernatanten weg en resuspendeer de pellets in 200 µl HBSS 2% FCS.
9. Breng de gesuspendeerde cellen over in nieuwe, gelabelde FACS-buisjes.
10. Evalueer met behulp van flowcytometrie, zoals weergegeven in het FACS-protocol, de aanwezigheid van CD45.2-positieve lymfocyten.

6. Gegevensanalyse

1. Open de FlowJo software en sleep de bestanden voor elke buis in het Alle monsters venster.
2. Dubbelklik op het overgebracht bestand om de cellen weer te geven die van dat monster zijn opgenomen op een stipplot die voorwaartse verspreid