Test voor celdood: Chromium-afgifte-assay van cytotoxisch vermogen

In deze video zult u zien hoe u de chromium-release test uitvoert en het cytotoxische potentieel van de effectorcellen bepaalt.

Immuncellen zijn verantwoordelijk voor het identificeren en verwijderen van potentieel schadelijke cellen, zoals kanker of virus-geïnfecteerde cellen, uit het lichaam, wat een integraal onderdeel is van de immuunrespons. Verschillende immuuncellen, zoals T-cellen en NK-cellen, bezitten een eigenschap die bekend staat als cytotoxisch potentieel, wat de capaciteit is om doelcellen te identificeren en eiwitten af te scheiden die eiwitdegradatie, lysis en dood van die doelcellen induceren. Het kwantificeren van cytotoxisch potentieel is van cruciaal belang voor het meten van immuuncelactivatie en -potentie, en de chromium-release test wordt veelvuldig gebruikt voor dit doel.

Deze methode stelt gebruikers in staat om de door specifieke typen immuuncellen geïnduceerde cytotoxiciteit te vergelijken onder verschillende omstandigheden, wat waardevol is voor het bestuderen van kankerimmunotherapie en immuungerelateerde ziekten. Om te beginnen worden de doelcellen, zoals kankercellen, geïncubeerd met een radioactief isotoop, chromium 51, dat door de cellen wordt opgenomen. Vervolgens worden deze radioactief gelabelde cellen geco-cultiveerd met de geïsoleerde immuuncellen van belang, ook wel de effectorcellen genoemd, in een ronde bodem, 96-well plate om interactie tussen de twee celtypen te vergemakkelijken.

De algehele opzet van de test omvat het incuberen van een specifiek aantal doelcellen met verschillende concentraties van de immuuncellen, samen met geschikte controles. De co-cultuur stelt de effectorcellen in staat om apoptose en lysis in de doelcellen te induceren, wat resulteert in de vrijlating van het intracellulaire chromium 51 in de supernatant. Vervolgens wordt, op een vooraf geoptimaliseerd tijdstip, de supernatant die het vrijgelaten chromium bevat, geoogst uit alle wells. Het chromium 51, dat radioactief is, ondergaat spontaan radioactief verval om gammastraling uit te zenden. De gammastralingniveaus in de supernatanten van alle wells in de testplaat vertegenwoordigen een meetbare uitvoer van de lysis van de doelcellen. Dit wordt gemeten met behulp van een gammateller, die vervolgens wordt gebruikt om het cytotoxische potentieel van de immuuncellen te bepalen.

Om te beginnen worden de doelcellen, in dit voorbeeld de humane melanoomcellijn WM793, bereid tot een enkele celsuspensie. Om dit te doen, verwijdert u eerst het medium uit de weefselcultuurkolf en wast u de cellen met vijf milliliter 1X PBS. Decanteer de PBS en voeg vervolgens een milliliter trypsine toe aan de plaat gedurende ongeveer twee minuten. Tik voorzichtig op de fles om de cellen los te maken van het flesoppervlak en voeg vervolgens vijf milliliter RPMI-medium toe aan de fles. Pipetteer het medium op en neer om de cellen te verzamelen en voeg deze suspensie toe aan een 15 milliliter conische buis.

Plaats de buis gedurende vijf minuten in de centrifuge bij 1200 RPM. Vervolgens verwijdert u het medium uit de buis en zorgt u ervoor dat u de celpellet niet verstoort. Tik voorzichtig op de bodem van de buis om de celpellet te verstoorden en voeg 10 milliliter medium toe aan de buis. Pipetteer vervolgens voorzichtig het medium op en neer om de cellen in suspensie te brengen. Bepaal vervolgens de celconcentratie met behulp van een hemocytometers en breng twee milliliter van de oorspronkelijke celsuspensie over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis. Plaats de buis in een centrifuge en pellet de cellen bij 1200 RPM gedurende vijf minuten. Na centrifugatie giet u het overtollige medium uit de buis in een afvalcontainer. Kortjes vortex de buis om de celpellet op te schorsen in het kleine volume medium dat achterblijft.

Bereid vervolgens het gebruik van Chromium 51 voor door naar een laboratoriumruimte te gaan die is gewijd aan deze specifieke radioactiviteit. Er moet voldoende loodbescherming zijn voor veilige opslag en gebruik van het Chromium 51 tijdens alle stappen, evenals een juiste bewegingsbord om aan te geven waar monsters met Chromium 51 worden bewaard. Een Geigerteller uitgerust met een pannenkoekensonde is ook noodzakelijk om in de ruimte te dienen voor mogelijke contaminatie.

Zodra het is ingesteld voor het juiste gebruik van radioactiviteit, voegt u 100 microcuries Chromium 51 rechtstreeks toe aan de doelcelsuspensie. Voeg vervolgens een klein stukje radioactief plakband toe aan de buis om aan te geven dat het monster en de buis nu radioactief zijn. Plaats de buis in een 37 graden Celsius incubator met een loodschild en incubeer gedurende een uur, waarbij u de buis elke 15 tot 20 minuten tikt.

Terwijl de doelcellen worden gelabeld, bereidt u een enkele celsuspensie van effectorcellen voor. In dit voorbeeld werden humane perifere bloedmononucleaire cellen, of PDMC's, geïsoleerd uit volbloed door standaard dichtheidsgradiëntcentrifugatie tot een concentratie van 5 maal 10 tot de 6e. Breng deze effectorcelsuspensie over in een wegwerpreagensreservoir en voeg vervolgens 200 microliters van deze suspensie toe aan elke well in rij B in een 96-well ronde bodemplaat. Voeg vervolgens 100 microliters RPMI toe aan elke well in rij C tot G van de plaat.

Nu begint u met het uitvoeren van seriële verdunningen van de PBMC's om een ​​reeks effectorcelnummers te hebben door eerst 100 microliters van de cellen in de wells in rij B te verwijderen en dit toe te voegen aan rij C. Vervolgens verdunt u de effectorcellen verder door 100 microliters cellen van rij C naar rij D over te brengen. Ga door met de seriële verdunning. Zodra rij G is bereikt, verplaatst u 100 microliters van de wells om een ​​eindvolume van 100 microliters in elke well in die rij te laten. Voeg vervolgens 100 microliters weefselcultuurmedium toe aan de wells in rij A om als controle te dienen voor de spontane vrijlating van Chromium 51 van de doelcellen, aangezien er geen effectorcellen aan deze rij mogen worden toegevoegd. Plaats vervolgens een plaat in een