Test voor celdood: Chromium-afgifte-assay van cytotoxisch vermogen

Procedure Overzicht

De typische ⁵¹Cr-release assay voor het meten van celdood omvat de volgende stappen:

1. Eerst worden de doelcellen gelabeld met Na₂[⁵¹Cr]O₄. Dit onderscheidt ze van de effectorcellen in de assay.
2. Terwijl de doelcellen worden gelabeld, worden de effectorcellen verzameld en, met behulp van de seriële verdunningstechniek, wordt een afnemende titratie van de effectorcellen gegenereerd in een ronde bodem 96-well assayplaat.
3. Aan het einde van de doelcelabeling worden de cellen eerst gewassen en vervolgens wordt een vast aantal cellen toegevoegd aan de assayplaat die al een reeks effectorcelverdunningen bevat.
4. Vervolgens wordt het doel-effector celmengsel gedurende een bepaalde periode geïncubeerd om voldoende celinteractie met de doelcellen mogelijk te maken, om cellyse te mediëren.
5. Ten slotte worden de cultuursupernatanten geoogst en in buisjes verzameld. De ⁵¹Cr hoeveelheid wordt gekwantificeerd met behulp van een gammateller.
6. Aan het einde worden de gegevens verzameld en gebruikt om het "percentage specifieke cellyse" van de doelcellen te berekenen.

1. Labelen van doelcellen met ⁵¹Cr

1. Om te beginnen, bereidt u de doelcellen, (hier- humane melanoomcel lijn WM793), in een enkele cel suspensie voor.
2. Om dit te doen, verwijdert u eerst het media van de weefselcultuurkolf.
3. Was vervolgens de cellen met 5 mL 1X PBS.
4. Trypsiniseren van de cellen door 1 mL trypsine toe te voegen aan de plaat voor ~2 min.
5. Tik zachtjes op de kolf om de cellen los te maken van het oppervlak van de kolf.
6. Voeg 5 mL RPMI media toe aan de kolf en pipet het media op en neer om de cellen los te maken.
7. Verzamel de celsuspensie in een 15 mL conische buis en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 1200 rpm. Decanteer het supernatant.
8. Voeg 10 mL media toe aan het pellet en pipet het media zachtjes op en neer om de cellen in suspensie te brengen.
9. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer.
10. Breng 1x10⁶ cellen over in een nieuwe 15 mL conische buis.
11. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 1200 rpm en decanteer het supernatant.
12. Vortex de buis kort om het cellulair pellet in het kleine volume medium dat achterblijft te resuspenderen.
13. Voeg 100 µCi van ⁵¹Cr direct toe aan de WM793 doelcel suspensie.
    Opmerking: Er moet een specifieke labruiimte beschikbaar zijn die is ingesteld voor de specifieke radioactiviteit. Bovendien moet er voldoende loodscherming zijn voor de veilige opslag en gebruik van de ⁵¹Cr gedurende alle stappen, evenals een goede bewegwijzering om aan te geven waar monsters met ⁵¹Cr worden bewaard. Een Geigerteller uitgerust met een pannenkoekensonde is ook noodzakelijk voor het onderzoeken van de ruimte op mogelijke besmetting.
14. Voeg een klein stukje radioactief tape toe aan de buis om aan te geven dat de buis nu radioactief is.
15. Plaats de buis in een 37°C incubator met een loodschild en incubeer gedurende 1 uur. Klik elke 15-20 minuten op de buis om de opname van chroom door de doelcellen te verhogen.
16. Na de incubatieperiode, was de doelcellen met 5 mL FBS om overtollig ⁵¹Cr te verwijderen.
17. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 1200 rpm. Decanteer radioactief FBS was in een geschikte afvalcontainer.
18. Resuspendeer het pellet en was een tweede keer met FBS. Controleer het pellet op geïncorporeerde radioactiviteit met behulp van een Geigerteller.
19. Resuspendeer het pellet in 10 mL compleet medium, waardoor een celconcentratie van 10⁵ cel/mL wordt bereikt.
    Opmerking: De celtellingsstap na de ⁵¹Cr-labeling is hier grotendeels weggelaten vanwege veiligheidsredenen. Er kan worden aangenomen dat de WM793-celconcentratie hetzelfde is als voor de ⁵¹Cr-labeling.

2. Voorbereiden van effectorcellen

1. Er kan een verscheidenheid aan effectorcellen worden gebruikt, zoals humane of muis T-cellen en NK-cellen. In dit voorbeeld werden PBMC's, geïsoleerd uit vol bloed door standaard dichtheidsgradiënt centrifugatie (tot een concentratie van 5x10⁶), gebruikt.
2. Om te beginnen, voegt u 100 µL weefselcultuurmedium toe aan elke put van een van de rijen (hier rij A, Zie Tabel 1) van een 96-well ronde bodem plaat. Hier worden geen effectorcellen toegevoegd en deze zullen dienen als 'blank' voor het bepalen van de "minimale/spontane ⁵¹Cr-release" van de doelcellen.

Tabel 1: ⁵¹Cr release assay lay-out: Rij A- Doelcellen (10⁴ cellen/ 100 µL) geïncubeerd met alleen media (genereert 'blank' voor het bepalen van de "minimale/spontane ⁵¹Cr-release"). Rijen B