Seriële verdunning en plateren: Microbiële enumeratie

Soms moeten we, om bacteriën te identificeren en te bestuderen, ze eerst isoleren en verrijken uit een monster. Bijvoorbeeld, monsters verkregen uit een Winogradsky Kolom zijn gemengd, wat betekent dat ze meerdere soorten of stammen van bacteriën bevatten, dus het bestuderen van een individuele bacterie of het tellen van de verschillende soorten die aanwezig zijn, kan een uitdaging zijn. Daarom worden serie-verdunning en plateertechnieken meestal gebruikt om de bacteriële belasting betrouwbaar te kwantificeren en individuele kolonies te isoleren.

Serie-verdunning is een proces waarbij de concentratie van een organisme, in dit geval bacteriën, systematisch wordt verlaagd door opeenvolgende hersuspensie in vaste volumes vloeibaar verdunningsmiddel. Meestal is het volume van het verdunningsmiddel een veelvoud van 10 om logaritmische vermindering van het monsterorganisme te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, één gram sediment wordt eerst verwijderd uit de Winogradsky zone van belang en toegevoegd aan 10 milliliter van een geschikt vloeibaar medium. Vervolgens wordt één milliliter van deze eerste verdunning toegevoegd aan een andere buis met negen milliliter medium. Het proces kan worden herhaald totdat verschillende concentraties bacteriën zijn bereid. Serie-verdunning is de sleutel tot het tellen van bacteriën in dit voorbeeld, aangezien gemengde monsters uit een Winogradsky Kolom een onbekend, vaak groot, aantal bacteriën bevatten.

Vervolgens maken strepen en spreiden het isoleren en tellen van bacteriën in een monster mogelijk, respectievelijk. Strepen wordt bereikt door een verdund monster in een sectie van het vaste medium met voedingsstoffen te introduceren, dat in drieën is verdeeld. Dit inoculum wordt vervolgens over elke derde van de plaat in een zigzagpatroon verspreid. Terwijl verschillende secties van de plaat worden gestrepen, kruisend van het vorige monster slechts één keer, wordt het monster dunner verspreid. Dit betekent dat je misschien slechts van één verdunning hoeft te streep om individuele kolonies in de latere secties te bereiken. Na incubatie, laten de gestrepte platen observaties van koloniemorfologie toe, informatie die kan helpen bij het onderscheiden tussen verschillende bacteriesoorten.

Alternatief, als het hoofddoel het tellen van de bacteriën in het monster is, kan spreidplaten worden gebruikt. Bij spreidplaten wordt een aliquot van een enkele monster gelijkmatig over het hele oppervlak van vast medium verspreid. Meestal, omdat we de bacterieaantal in het gemengde monster niet kennen, wordt een spreidplaat gemaakt voor elk van de verdunningsniveaus of een representatief voorbeeld van hen. Na incubatie, kan het tellen worden uitgevoerd met behulp van deze spreidplaten. Alle platen met kolonietellingen minder dan 30 moeten worden weggegooid, omdat kleine tellingen onderhevig zijn aan grotere fouten. Evenzo, moeten alle tellingen boven de 300 worden weggegooid omdat koloniedichtheid en overlapping kunnen leiden tot onderschatting van het kolonietelling. Als de kolonietelling van elk van deze resterende schotels wordt opgenomen en vermenigvuldigd met de verdunningsfactor, en vervolgens gedeeld door het geplateerde volume, levert dit de kolonievormingseenheden, of CFU's, per milliliter suspensie op. In deze video, leer je hoe je kwalitatief en kwantitatief een monster kunt evalueren dat een bekende bacterie bevat, en de microbiële gemeenschappen die in verschillende regio's van een Winogradsky Kolom via serie-verdunning, spreidplaten en strepen.

Ten eerste, trek aan geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen aan, inclusief een labjas, handschoenen en veiligheidsbril. Vervolgens, steriliseer het werkoppervlak met 70% ethanol en veeg het oppervlak schoon. Verzamel vervolgens twee 500 milliliter Erlenmeyer kolven en label een bouillon en de andere agar. Om LB agar oplossing te bereiden, meng ongeveer 6,25 gram LB agar, drie gram technisch agar en 250 milliliter gedistilleerd water in de fles gelabeld agar.

Bereid vervolgens LB bouillon door 2,5 gram LB media en 100 milliliter gedistilleerd water te combineren in de fles gelabeld bouillon. Na het autoclaveren van de flessen, gebruik een hittebestendige handschoen om de flessen uit de autoclaaf te verwijderen en plaats ze in een waterbad van 40 tot 50 graden Celsius. Zodra de flessen 50 graden Celsius zijn, bereid voorzichtig drie 100 milliliter aliquoten van de bouillonoplossing voor en label elke aliquotoplossing nul. Verzamel vervolgens 10 steriele petrischalen en label ze met de datum, naam, type medium gebruikt, en de Winogradsky Kolom zone waaruit de organismen zullen worden geoogst. Pipet 15 milliliter agar uit de agarfles in elke petrischaal. Gebruik vervolgens de pipettetip om eventuele bubbels te verwijderen, vervang de schoteldeksels, en laat ze overnacht op de werktafel stollen.

De volgende dag, veeg de werktafel schoon met 70% ethanol. Vervolgens, label 10 20 milliliter testbuisjes T1 tot en met T10 en plaats ze in een rek. Pipet negen milliliter van 0,45% zoutoplossing in elk buisje. Bedek nu elk van de 10 testbuisjes losjes met hun doppen en breng ze over naar een voor autoclaaf geschikte testbuisrek. Nadat de cyclus voltooid is, verwijder de zoutoplossingsblanks met hittebestendige handschoenen en laat ze afkoelen. Bewaar de buisjes bij kamertemperatuur tot ze ongeveer 22 graden Celsius hebben bereikt.

Om een bekend doelorganisme te cultiveren, E. coli in dit voorbeeld, inoculeer 100 milliliter oplossing nul met een enkele kolonie van een eerder gestrept plaatje. Dek vervolgens de buis af en incubeer deze een nacht bij 37 graden Celsius. Om de regio's van een Winogradsky Kolom te evalueren, voeg ongeveer één gram materiaal toe van de aërobe zone aan T1 en resuspendeer door te vortexen. Herhaal vervolgens dit proces met één gram materiaal van de anaërobe zone.

Verwijder de buis met oplossing nul geïnoculeerd met E. coli uit de incubator en schud het. Pipet vervolgens één milliliter van de oplossing in een T1 testbuis en vortex om te mengen. Verwijder één milliliter oplossing uit T1 en breng het over naar T2, vortex om te mengen. Herhaal dit proces door buis T10 he