Seriële verdunning en plateren: Microbiële enumeratie

1. Set-up

1. Een stroomschema met alle benodigde materialen, een stapsgewijs experimenteel protocol en een methode voor het weggooien van benodigdheden moet in een laboratoriumnotitieboekje worden geschreven en in de buurt van de experimentele werkruimte worden bewaard.
2. Werkruimtes moeten worden gesteriliseerd met een geschikt antisepticum (70% ethanol) en de experimentator moet het risico op besmetting beperken door schone laboratoriumkleding te dragen die hen ook beschermt tegen blootstellingsanomalien. Geschikte kleding omvat, maar is niet beperkt tot, een laboratoriumjas, latex of nitrilhandschoenen, veiligheidsbrillen, ademhalingsmaskers en gesloten schoenen. Het is van cruciaal belang om te allen tijde aseptische techniek te handhaven.
3. Bereid 90 mL 0,45% zoutoplossing. Meet met een schone meetcilinder 90 mL steriele water en breng het over in een schone Erlenmeyer-kolf gelabeld 0,45% zoutoplossing. Weeg 0,405 g natriumchloride (Sigma-Aldrich NaCl S9888) en voeg het toe aan de fles gelabeld 0,45% zoutoplossing. Roer herhaaldelijk totdat er geen opgeloste stof meer zichtbaar is.
4. Na voltooiing moet de experimentator alle oppervlakken opnieuw steriliseren en alle ongewenste organismen, verdunningsstocks, petrischalen of wegwerp-inoculatielussen weggooien volgens de OSHA-richtlijnen. Laboratoriumkleding kan worden verwijderd voor het wassen van de handen.

2. Mediavoorbereiding

1. Selecteer media die geschikt is voor het kweken van een gewenst organisme. In de meeste scenario's zou een bouillon voldoende bacteriegroei mogelijk maken. Aangezien hier organismen uit een Winogradsky-protocol gewenst zijn, werd een kolom bestaande uit calciumcarbonaat, zwavel, cellulose en modder geassembleerd en 7 dagen ongestoord gelaten. De genoemde kolom is verdeeld in aërobe, micro-aërobe en anaërobe secties.
2. Kies een medium dat geschikt is voor het beplaten van het organisme van belang. Supplementatie van vloeibaar media met microbiologie kwaliteit agar wordt meestal gebruikt als verhardingsmiddel. LB-medium/agar is voldoende bij het oogsten van monsters uit de aërobe, micro-aërobe en anaërobe gebieden van de genoemde kolom. Opmerking: monsters uit het micro-aërobe gebied werden niet voor deze procedure geoogst. Deze organismen moeten echter in kaarsflessen worden gekweekt. Het introduceren van een kaars in deze kweekkamer voordat deze wordt afgesloten, creëert een lage zuurstof omgeving die geschikt is voor micro-aërobe proliferatie.
3. Aangezien we 250 mL willen bereiden, gebruik 500 mL (of groter) Erlenmeyer-kolven om overkoken te voorkomen tijdens het autoclaveren. Label een "Bouillon" en de andere "Agar."
4. Bepaal de hoeveelheid media die nodig is om elke oplossing te maken door de aanbevelingen van de fabrikant voor de concentratie te volgen. LB-Agar, hier gebruikt, wordt bereid door 25g/L te combineren met ultrapuur water. Ons volume van 250 mL vereist een oplossing van 6,25 LB-Agar/250 mL water. Evenzo wordt LB-Bouillon bereid door dezelfde verhouding van LB-Bouillon en water te combineren. Aangezien het niet is aangevuld met een verhardingsmiddel, zal het niet hard worden wanneer het wordt afgekoeld.
5. Weeg het medium en meng het met water in verhoudingen die consistent zijn met de aanbevelingen van de fabrikant. Voeg 6,25g LB-Agar toe aan een fles gelabeld "Agar", en 6,25g LB-Bouillon aan een fles gelabeld "Bouillon." Voeg 250 mL ultrapuur water toe aan elke fles.
6. Wickel aluminiumfolie over elke fles en gebruik een autoclaaf om media te steriliseren voor minimaal 15 minuten bij 121°C, 15 psi.
7. Verwijder de flessen uit de autoclaaf met een hittebestendige handschoen of pad wanneer de cyclus voltooid is en plaats ze in een waterbad van 40-50°C.
8. Zodra de juiste temperatuur is bereikt, giet de inhoud van de fles gelabeld "Bouillon" in een 250 mL Erlenmeyer of ronde bodemkolf. Label de 250 mL fles "oplossing₀".
9. Verkrijg 10, 100mm x 15 mm steriele petrischalen en label ze met de datum, naam, het type media dat wordt gebruikt en de Winogradsky-kolomzone waaruit organismen worden geoogst.
10. Verwijder de fles gelabeld "Agar" uit het waterbad en begin met gieten in elk van de 10 petrischalen. Er mag niet meer dan 15 mL aan elke schaal worden toegevoegd. Dit kan ook worden uitgevoerd met een pipettor en 25 mL serologische pipet om de nauwkeurigheid te verbeteren. Gebruik een steriele pipettetip om eventuele aanwezige luchtbellen te verwijderen en dek vervolgens af met de schaaldeksels en laat overnacht vasten.

3. Verdunningsvoorbereiding

1. Bereid tien testbuisjes voor die in staat zijn om 20 mL of meer te bevatten in een rek en label ze T1-T10. Elk buisjenummer is consistent met de verdunningsfactor waar het aan overeenkomt (bijv. T4 = 1x10^-4 of 0,0001 of 1/10.000 van de stockconcentratie).
2. Pipet 9 mL 0,45% zoutoplossing in elk van de 10 testbuisjes.
3. Zoutoplossing blanks zijn nu klaar om te worden gesteriliseerd door autoclave. Gebruik aluminiumfolie om elk van de 10 testbuisjes te bedekken en breng ze vervolgens over in een voor autoclaaf geschikte testbuisrek. Steriliseer gedurende minimaal 15 minuten bij 121°C, 15 psi.
4. Verwijder blanks met hittebestendige handschoenen en laat afkoelen. Dek af en bewaar bij 4°C tot ze nodig zijn wanneer de buisjes op kamertemperatuur zijn bereikt, of wanneer ze koud zijn om aan te raken.