Zuivere culturen en uitstrijkje-beplating: Isolatie van enkele bacteriekolonies uit een gemengd monster

1. Set up

1. Alle microben moeten worden behandeld alsof ze gevaarlijk zijn. Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen, bind lang haar vast en zorg ervoor dat eventuele wonden extra goed worden beschermd.
2. Maak de werkruimte klaar door deze te steriliseren met 70% ethanol.
3. Zorg ervoor dat agarplaten, monsteroplossingen en een doos met voorgesteriliseerde plastic inoculatielussen of een metalen lus plus een Bunsen-vlam binnen handbereik liggen. Wegwerpbare, plastic lussen zijn doorgaans voorgesteriliseerde. Metalen lussen moeten worden gedompeld in 70% ethanol en vervolgens in de buurt van het blauwe gebied van een Bunsen-vlam worden gehouden en worden verhit tot ze gloeiend heet zijn. Laat de draad afkoelen door het deksel van de plaat te openen (alleen een beetje om besmetting te voorkomen) en tik erop tegen het gestolde medium.
4. Sluit elke procedure af met een herhaalde sterilisatie van de werkruimte en een grondige wassing/sterilisatie van handen en polsen.

2. Protocol

1. Bereiding van media
   1. Identificeer en bereid een vast medium (meestal bevattend 1,5% (w/v) agar) dat de gebruikte bacteriesoort/stam zal ondersteunen. Meng het medium in een fles die twee keer het eindvolume kan bevatten om overloop bij het autoclaveren te voorkomen.
   2. Steriliseer het medium door de fles, met een semi-strak gesloten dop, in een autoclaaf te plaatsen ingesteld op 121°C gedurende 20 min.
   3. Sluit de dop goed zodra de fles uit de autoclaaf is verwijderd. Als het medium binnenkort wordt gebruikt, plaats de fles in een waterbad ingesteld op 45°C om het in een vloeibare staat te bewaren. De agar zal anders gaan stollen bij minder dan 32-40°C, en kan later worden opgewarmd (meestal met behulp van een magnetron) tot een smeltpunt van 85°C.
2. Bereiding van kweekplaat(en)
   1. Markeer de basis van steriele Petri-schijven (meestal 100 x 15 mm) aan de zijkant of de onderkant met de naam van de experimentator, de datum en het type medium.
   2. Plaats 20-25 mL van 45°C agar-kweekmedium (vooraf bereid) in elk van de geëtiketteerde platen. Als er schuim langs de randen verschijnt, moet dit snel worden verwijderd met behulp van een reguliere pipette en een steriele tip.
   3. Plaats onmiddellijk alle deksels terug op de schalen om besmetting te voorkomen.
   4. Laat de agar ongeveer 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C stollen. Eenmaal vast, moeten bacteriële kweekplaten vervolgens ondersteboven bij 4°C worden bewaard om condensatie op het mediumoppervlak te minimaliseren.
3. Streekplateren
   1. Dompel een steriele lus onder in het gewenste inoculum en verspreid onmiddellijk het verzamelde monster op het eerste kwadrant van de plaat met een zigzagbeweging (Figuur 1, I).
   2. Sluit het deksel en steriliseer de inoculatielus opnieuw of verzamel een nieuwe steriele wegwerplus.
   3. Maak 3-4 streken die uitstralen van het eerste kwadrant (met een relatief dichte bacteriepopulatie) naar het tweede kwadrant van de plaat (Figuur 1, II).
   4. Sluit het deksel en steriliseer de inoculatielus opnieuw of gooi de wegwerplus weg en verzamel een nieuwe steriele.
   5. Herhaal dit strekken van 3-4 streken van het tweede naar het derde kwadrant, en vervolgens van het derde naar het vierde kwadrant, telkens met een steriele lus (Figuur 1, III - IV).
   6. Maak met een steriele lus een laatste streek in een zigzagpatroon van het vierde kwadrant naar het midden van de plaat (Figuur 1, V). De bacteriële prevalentie zal in dit gebied lager zijn, waardoor er idealiter individuele kolonies kunnen worden gevestigd vanuit een enkele, levensvatbare moedercel.
   7. Sluit het deksel en (indien vereist door de bacteriesoort) verzegel met parafilm om luchtstroom te voorkomen.
   8. Plaats, afhankelijk van de bacteriesoort/stam, de kweekplaat ondersteboven in een geschikte omgeving en incubeer totdat bacteriekolonies zichtbaar zijn (gescheiden kolonies kunnen in elk gebied van de plaat verschijnen omdat de initiële concentratie kan variëren).
   9. Om een klonale bacteriepopulatie te genereren, strekt u een andere plaat uit en wisselt u het inoculum dat op de originele plaat is geplaatst voor cellen geïsoleerd uit een enkele kolonie van de originele plaat.