Groeicurves: Het genereren van groeicurven met behulp van kolonievormende eenheden en optische dichtheidsmetingen

1. Set-up

1. Benodigdheden voor het laboratorium: vloeibaar medium, gestold agar-medium, Erlenmeyer kolven, 15 mL testbuisjes, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), bacterieel celverspreider, 70% ethanol en een spectrofotometer. Alle oplossingen en glaswerk moeten worden gesteriliseerd voor gebruik.
2. Bereid de werkplek voor door te steriliseren met 70% ethanol. Werk in de buurt van een Bunsenbrander om besmetting van het medium te voorkomen.
3. Bij het werken met bacteriën moeten de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en aseptische techniek worden gebruikt. Een laboratoriumjas en handschoenen zijn vereist bij het werken met bacterieculturen.
4. Recepten voor buffers, oplossingen en reagentia
   1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (8).
   2. Luria-Bertani Broth (LB) (9).

2. Protocol

1. Bereiding van Media
   1. Identificeer het groeimedium waarmee de bacteriën worden gekweekt en bereid zowel vloeibaar bouillon als vast agar (1,5% w/v agar) medium in afzonderlijke autoclaveerbare flessen. Hier werden LB-bouillon en LB-agar bereid voor de groei van Escherichia coli.
   2. Steriliseer het medium met een semi-vastgedraaide dop in een autoclaaf ingesteld op 121 °C gedurende 35 min.
   3. Voor agar-medium, na het autoclaveren, plaats in een waterbad ingesteld op 50 °C gedurende 30 minuten om af te koelen. Eenmaal afgekoeld, giet 20-25 mL agar-medium in 100x15mm ronde Petri-schijven. Laat de platen 24 uur op kamertemperatuur stollen voor gebruik.
2. Initiële voorbereiding van bacteriën
   1. Van bevroren voorraad, streken bacteriën voor isolatie op geselecteerde media-agar om enkele kolonie-isolaat te verkrijgen. Incuberen in groeiomstandigheden die voor de gekozen bacteriën zijn toegestaan. Hier wordt E. coli op LB-agar gestreken en gedurende 37 °C overnacht (16-18h) geïncubeerd.
   2. Gebruik een steriele inoculatorlus om een enkele kolonie van de streekplaat te selecteren en inoculeer 4 mL vloeibaar medium in een 15 mL testbuis en groei in de omstandigheden die voor de gekozen bacteriën zijn toegestaan. Hier wordt E. coli gedurende 37 °C geteeld met schudden bij 210 rpm overnacht (16-18h).
3. Instelling van de groeicurve
   1. Voorbereiding van groeiflask
      1. Autoclaveer geschikte grootte Erlenmeyer kolven. Typisch wordt een 1:5 verhouding van medium tot totale flesvolume gebruikt. Hier wordt 100 mL LB-medium gebruikt in een 500 mL fles.
      2. Gebruik een serologische pipette om steriele media naar de Erlenmeyer kolf over te brengen.
   2. Voorbereiding van verdunningsreeks
      1. Label 15 mL testbuisjes: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, en -9, verdeel 9mL PBS in elk. Deze cijfers komen overeen met de verdunningsfactor die wordt gebruikt om CFU/mL te berekenen. Voor elke verzamelingstijdstip is een nieuwe set buisjes nodig. (Figuur 2)
   3. Voorbereiding van agar-plaat
      1. Label platen met tijdstip van verzameling en verdunningsfactor. Voor elk tijdstip zal er één plaat zijn voor elke verdunning.
4. Groeicurve protocol
   1. Inoculatie van media
      1. Gebruik de overnachtelijke vloeibare cultuur die als onderdeel van stap 2.2.2 is bereid, om de flesmedia te inoculeren met 1:1000 volume van cultuur. Hier wordt 100 μL overnachtelijke vloeibare cultuur toegevoegd aan 100 mL LB-medium.
      2. Zwiep de media om de bacteriën gelijkmatig te verdelen.
   2. Tijdstip verzameling
      1. Instelling van groeiconditiën
         1. Plaats de fles in de experimentele groeiconditiën die zijn gekozen voor de gegeven bacteriën. Tijdstippen moeten vaak worden genomen voor snelgroeiende bacteriën en kunnen met langere intervallen worden genomen voor langzaam groeiende bacteriën. Hier wordt E. coli gedurende 37°C geteeld met schudden bij 210 omwentelingen per minuut (rpm) en tijdstippen worden genomen om de uur.
      2. Optische dichtheid (OD600) meting
         1. Bij elk tijdstip, inclusief het starttijdstip (t = 0), trek 1 mL van de bacteriecultuur en doseer in een spectrofotometer cuvet.
         2. Veeg de cuvet schoon en noteer de optische dichtheid bij 600 nm golflengte. Als de optische dichtheidswaarde groter is dan 1,0, verdun 100 μL van de cultuur 1:10 met 900 μL vers medium, noteer de optische dichtheid en vermenigvuldig deze waarde met 10 voor de OD600 meting.
      3. Meting van kolonievormende eenheid (CFU/mL)
         1. Bij elk tijdstip, trek 1 mL van de bacteriecultuur en doseer in de -1 glazen testbuis met 9 mL PBS.
         2. Voor de verdunningsreeks, breng seriëel 1 mL van de -1 buis over naar alle verdunningsbuizen tot de -9, terwijl na elke overbrenging wordt gevormd. (Figuur 2)
         3. Voor elke verdunning, doseer 100 μL van de celsuspensie op de overeenkomstig gelabelde vaste media-agarplaat. (Figuur 2)
         4. Gebruik een celverspreider