Antibiotica Gevoeligheidstesten: Epsilometer Tests om MIC-waarden van Twee Antibiotica te Bepalen en Antibiotica Synergie te Evalueren

1. Epsilometer testen (E-tests)

1. Voorbereiding
   1. Draag handschoenen en een laboratoriumjas
   2. Maak de werkruimte klaar door deze te steriliseren met 70% ethanol
   3. Verzamel Mueller-Hinton agar platen (MHA platen)
2. Bereiding van een McFarland turbiditeitsstandaard Nr. 0,5
   1. Bereid een 1% oplossing van bariumchloride (BaCl₂):
      Voeg 1 gram watervrij bariumchloride (BaCl₂) toe aan 100 mL gedestilleerd water. Vorm goed.
   2. Bereid een 1% oplossing van zwavelzuur (H₂SO₄):
      Voeg 1 mL geconcentreerd H₂SO₄ toe aan 99 mL gedestilleerd water. Vorm goed.
   3. Bereid een McFarland turbiditeitsstandaard Nr. 0,5:
      50 µL BaCl₂ oplossing in 5 mL van 1% H₂SO₄ oplossing. Vorm de oplossing goed om een troebele suspensie te krijgen.
   4. Bewaar de McFarland turbiditeitsstandaard Nr. 0,5 in een met folie bedekt buisje. Bewaar bij 25°C gedurende maximaal 6 maanden. Vorm goed tot een homogene oplossing voor gebruik.
3. Bereiding van MHA platen
   1. Schraap Streptococcus groep G bacteriën van een bloedagar plaat met een steriele lus. Meng in 1mL zoutoplossing en vorm tot een suspensie van de bacteriën.
   2. Vergelijk de suspensie met een McFarland standaard Nr. 0,5 om dezelfde turbiditeit te bereiken om dezelfde inoculum grootte te hebben tijdens de experimenten. Pas de concentratie aan met behulp van extra zoutoplossing of bacteriën.
   3. Inoculeer de MHA platen door een steriele katoenen applicator te gebruiken. Veeg de plaat voorzichtig om het oppervlak te bedekken. Ga verder met een van de drie onderstaande methoden (1.4-1.6).
4. Enkel antibioticaresistentietest. Streptococcus groep G, resistentie tegen penicilline G of gentamicine
   1. Plaats een E-test strip (ofwel penicilline G of gentamicine) in het midden van de MHA plaat (Figuur 1 A,B).
   2. Incubeer gedurende 18-20 uur, 37°C.
   3. Lees de resultaten. MIC wordt gemeten als de remmingszone die de gegradueerde antibiotica test strip snijdt (Figuur 1 C,D).

Figuur 1: Enkele E-test. Plaatsing van een E-test strip van A) penicilline G en B) gentamicine op een Mueller Hinton agar plaat bedekt met bacteriekolonies van een groep G streptokokken voor (A en B) en na (C en D) overnacht incubatie bij 37°C 5% CO₂. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Synergie testen kruis-aanpak. Streptococcus groep G, resistentie tegen penicilline G en gentamicine.
   1. Plaats twee E-test strips met verschillende antibiotica (bijv. penicilline G en gentamicine) op de geïnoculeerde MHA plaat in een kruisvormige opstelling.
      1. Voor de meest nauwkeurige resultaten, plaats de kruising op een ongeveer 90° hoek op het kruispunt tussen de schalen op hun MIC waarden, eerder bepaald in de enkel antibioticaresistentie test (Figuur 2 A).
      2. Let op dat de strips eenmaal op de agar plaat zijn geplaatst, ze niet mogen worden verplaatst, aangezien sommige antibiotica mogelijk al door de plaat zijn geabsorbeerd. Daarom is het beter om de strips op een licht verkeerde hoek te houden (bijv. 85°) en tot 1-2 mm van de werkelijke MIC-waarde. Het is aan te raden om het experiment in drievoudige uitvoering uit te voeren om dit probleem te verminderen.
   2. Incubeer gedurende 18-20 uur, 37°C.
   3. Lees de resultaten. MIC wordt gemeten als de remmingszone die de gegradueerde antibiotica test strip op elke respectieve E-test strip snijdt (Figuur 2 B).
   4. Gebruik de formule voor fractionele remmingsconcentratie (FIC) (Vergelijking 1) om synergie te bepalen.

Figuur 2: Synergisme detectie - kruistest. Resultaten van antimicrobiële synergie testen van MIC van penicilline G en gentamicine op Streptococcus groep G voor (A) en na (B) overnacht incubatie bij 37°C 5% CO₂. Er wordt een hoek van 90° gevormd tussen de twee individuele MIC-waarden (penicilline G: 0,094 µg/