Plaque Assay: Een methode om het virale titer te bepalen als plaquevormende eenheden (PFU)

1. Voorbereiding

1. Voordat u begint met werk dat microben betreft, moet u ervoor zorgen dat de werkruimte gesteriliseerd is (bijv. afgeveegd met 70% ethanol). Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen, bind lang haar terug en zorg ervoor dat alle wonden goed beschermd zijn.
2. Als u klaar bent, steriliseer alle oppervlakken en was/steriliseer handen en polsen grondig.

2. Protocol

1. Voorbereiding LB-medium
   Opmerking: Afhankelijk van de gastheerbacteriestam en de bacteriofaag, kan een ander vloeibaar medium geschikter zijn voor de eerste cultivering van de gastheerbacteriestam of een ander vast medium kan geschikter zijn voor de volgende groei. Lysogeen bouillon (LB) wordt in dit protocol gebruikt voor het bouillon en het agar.
   1. Meng 4 g LB in 200 mL gedistilleerd water, in drievoud, voor het LB-bouillon, het vaste bodemagar en de zachte toplaag agar. Alle oplossingen moeten worden bereid in containers die twee keer het eindvolume kunnen bevatten om overstroming tijdens het autoclaveren te voorkomen.
      Opmerking: Als u de test in drievoud uitvoert, bereid dan dubbel de hoeveelheid LB-bodemagar voor.
   2. Stel de pH van alle drie de oplossingen in op 7,4 met NaOH of HCl, naargelang het geval.
   3. Voeg 3 g agarpoeder toe aan de bodemagar fles om een 1,5% agaroplossing te maken voor de vaste agar
   4. Voeg 1,2 g agarpoeder toe aan de toplaag fles om een 0,6% agaroplossing te maken voor zachte agar.
   5. Plaats de flessen, met halfgesloten doppen, in een autoclaaf ingesteld op 121°C gedurende 20 min om de oplossingen te steriliseren. Sluit de doppen zodra de run is voltooid om besmetting te voorkomen.
   6. Wanneer het LB-medium een temperatuur van ongeveer 45-50°C heeft bereikt, voeg 450 μL steriele 1 M CaCl₂ toe aan alle drie de 200 mL LB-oplossingen om een eindconcentratie van 2,25 mM te maken.
   7. Plaats 15 mL afmetingen van het vaste agarmedium in steriele Petri-schotels (schud niet om schuimen te voorkomen) en laat de agar enkele uren of een nacht op kamertemperatuur stollen (Figuur 4A). Platen kunnen enkele dagen ondersteboven bij 4°C worden bewaard.
2. Cultiveren van gastheercellen
   1. Een dag voor de test, voeg 10 μL E. coli cultuur toe aan 10 mL LB-bouillon.
   2. Incubeer de bacteriën bij 37°C een nacht bij 160 rpm in een schudkuvette.
   3. De ochtend van de test, voeg 0,5 mL van de overnachtingscultuur toe aan 10 mL verse LB.
      Opmerking: Als u de test in drievoud uitvoert, bereid dan dubbel de hoeveelheid van deze cultuur voor.
   4. Incubeer de bij 37°C bij 160 rpm in een schudkuvette tot de bacteriecultuur zich in de log-fase van groei bevindt. Dit kan spectrofotometrisch worden bepaald door een OD600 van 0,5-0,7.
   5. Bewaar de cultuur op kamertemperatuur totdat de bacteriën aan de bovenste LB-agar moeten worden toegevoegd.
3. 10-voudige steriele verdunning van bacteriofaag
   1. Voeg 180μL LB-bouillon toe aan zeven putjes in de eerste rij van een 96-putjesplaat
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om de verdunning in drievoud uit te voeren om de statistische betrouwbaarheid te verhogen. Om dit te doen, bereidt u aanvullende verdunningen van de bacteriofaag in de tweede en derde rijen van de plaat voor.
   2. Vortex de oorspronkelijke bacteriofaagmonster zorgvuldig om homogeniteit te garanderen en breng 20 μL over naar de eerste put.
   3. Meng het monsterputje door pipetteren en naar beneden.
   4. Breng 20 μL van de resulterende suspensie over naar de tweede put.
   5. Vervolg de steriele verdunning door 20 μL van de oplossing in de tweede put over te brengen naar de derde put, en zo verder, tot de zesde put, waarbij de zevende put als negatieve controle wordt achtergelaten waaraan geen faagsuspensie wordt toegevoegd. Dit zal een verdunningsbereik van 10^-1-10^-6 creëren.
4. Plateren
   1. Label de basis van de Petri-schotels (eerder bereid in stap 2.1.7) met naam, datum en een korte steekproefbeschrijving (inclusief de verdunningsfactor van het faagmonster). Verwarm de Petri-schotels een uur voorafgaand aan de test in een 37°C-incubator.
   2. Smelt het gestolde zachte agar-medium (meestal gedaan met behulp van een magnetron; gestold agar smelt bij 85°C) en laat het op ongeveer 45°C komen. Het verwarmde medium kan in een 45°C waterbad gedurende ~1 uur worden geplaatst om een geschikte temperatuur te bereiken. Het moet heet genoeg zijn om in vloeibare vorm te blijven, maar koel genoeg om toegevoegde bacteriën niet te doden.
   3. Meng 4 mL bacteriecultuur (uit stap 2.2) met 35 mL LB zachte agar (bij 45°C). Draai om om de cellen gelijkmatig te verdelen, maar schud niet om schuimen te voorkomen (Figuur 4A).
   4. Label één steriele testbuis voor elk van de steriele verdunningsstappen en één voor het controlemonster, voor een totaal van 7 gelabelde testbuizen. Plaats 5 mL