Transformatie van E. coli-cellen met behulp van een aangepaste calciumchlorideprocedure

Dit protocol beschrijft de bereiding en transformatie van competente E. coli DH5α met behulp van een aanpassing van de calciumchloride procedure (12).

1. Opzetten

1. Uitrusting
   • Spectrofotometer
   • Sorval Centrifuge (of equivalent)
   • Centrifuge op tafel
   • Heat block of waterbad
   • Orbitale schudler
   • Stationaire incubator
   • Gelgietbakje
   • Well combs
   • Spanningsbron
   • Gelbox
   • UV lichtbron
   • Microgolfoven
2. Oplossingen en reagentia
   • Luria-Bertani (LB) bouillon (10 g caseïne enzymische hydrolysaat, 5 g gistextract en 5 g natriumchloride in 1000 mL H₂O)
   • Super Optimale bouillon met Catabolite repressie (SOC): (2% (w/v) tryptone, 0,5% (w/v) gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ en 20 mM glucose)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) oplossing.
   • M CaCl₂ oplossing (als cellen onmiddellijk getransformeerd worden) of 0,1M CaCl₂ oplossing bevattende 10% (v/v) glycerol (als cellen bevroren worden voor later gebruik).
   • LB agar platen
   • LB agar selectieve platen (voor dit experiment, aangezien de gebruikte plasmide ampicilline resistentie verleent, werden LB agar platen met 100 µg/mL ampicilline gebruikt)
   • E. coli DH5α stam
   • Plasmid pUC19 DNA (100 pg/µl)
   • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)
   • HindIII restrictie-enzym
   • 1 kb plus DNA ladder
   • Low Melting Point Agarose
   • 1X TAE buffer (40 mM Tris Base, 20 mM Azijnzuur en 1mM EDTA)
   • Ethidium Bromide (10mg/mL)
3. Algemene veiligheidsopmerkingen
   E. coli DH5α is geclassificeerd als Bioveiligheidsniveau 1 (BSL1). Microben in deze categorie vormen weinig tot geen bedreiging van infectie bij gezonde volwassenen. Echter, zorgvuldige manipulatie van de micro-organismen is vereist.

BELANGRIJK: alle stappen in dit protocol moeten worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken en op ijs of 4°C tenzij anders aangegeven.

2. Protocol

1. Van een bevroren voorraad van E. coli DH5α (bevroren in 20% glycerol van een overnacht gekweekte cultuur in LB) bacteriën uitstrekken voor isolatie op een LB agar plaat. Incubeer bij 37°C overnacht (16-20 uur).
2. Een enkele kolonie inoculeren in 3 mL LB bouillon in een buis. Laten groeien met schudden bij 210 rpm bij 37°C overnacht (16-20 uur).
3. Meet de OD600 van de overnacht cultuur. Gebruik de overnacht cultuur om 100 mL LB bouillon in een 1-liter fles te inoculeren tot een OD600=0,01. Incubeer de cultuur met krachtig schudden (210 rpm) bij 37°C en monitor de OD600 in de spectrofotometer elke 15-20 min, tot de cultuur een OD600=0,35 bereikt (ongeveer 3 uur).
   OPMERKING: Voor een efficiënte transformatie moeten bacteriële cellen zich in de midden-exponentiële groeifase bevinden. Het maximale aantal cellen dient 10⁸ cellen/mL te zijn, wat voor de meeste stammen van E. coli overeenkomt met een OD600=0,4. Het gebruik van de spectrofotometer maakt het mogelijk om de OD600 te meten, waardoor bepaald kan worden of de cellen zich in de juiste groeifase bevinden. Indien dit protocol voor andere bacteriestammen wordt gebruikt, zal calibratie nodig zijn om het aantal kolonievormingseenheden bij specifieke OD600 waarden te bepalen om deze correlatie vast te stellen.
4. Breng de 50 mL van de cultuur over in elk van 2 ijskoud polypropyleen centrifugebuisjes. Plaats de buisjes op ijs gedurende 20 min om af te koelen.
5. Herstel de cellen door centrifugatie bij 2700g (4100 rpm in een Sorval GSA rotor) gedurende 10 min bij 4°C.
6. Verwijder het supernatant. Laat de laatste resten media weglopen door de buisjes ondersteboven op een papieren handdoek te plaatsen.
7. Resuspendeer elk bacterieel pellet in 30 mL van een ijskoude CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) oplossing. Voeg eerst 5 mL van de oplossing toe, zwiep voorzichtig tot het pellet volledig is opgelost en voeg vervolgens de resterende 25 mL oplossing toe.
8. Herhaal stap 2.4.
9. Herhaal stap 2.5.
10. Als competente cellen direct getransformeerd worden, resuspendeer elk bacterieel pellet in 2 mL van een ijskoude CaCl₂ (0,1 M) oplossing door de buisjes voorzichtig te zwiepen. Indien het pellet niet wordt opgelost met deze methode, resuspendeer door voorzichtig op en neer te pipetten (zonder bellen te vormen).
    Alternatief kunnen de competente cellen worden bevroren en bewaard voor later gebruik. Om bevroren voorraden van competente cellen te bereiden, resuspendeer het pellet in 2 ml van een 0,1M CaCl₂ oplossing bevattende 10% (v/v) glycerol. Deze oplossing dient ijskoud te zijn. Verdeel de cel