$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bacteriën zijn opmerkelijk aanpasbaar en een mechanisme dat deze aanpassing vergemakkelijkt, is hun vermogen om externe DNA-moleculen op te nemen. Een type DNA dat bacteriën kunnen opnemen, wordt een plasmide genoemd, een circulair stukje DNA dat vaak nuttige informatie bevat, zoals genen voor antibioticaresistentie. Het proces waarbij bacteriën worden gemodificeerd door nieuwe genetische informatie die uit een externe bron is opgenomen, wordt transformatie genoemd. Transformatie kan eenvoudig worden uitgevoerd in het laboratorium met behulp van Escherichia coli, of E. coli.
Om te worden getransformeerd, moeten E. coli-cellen eerst competent worden gemaakt, wat betekent dat ze in staat zijn om DNA-moleculen uit hun omgeving op te nemen. Het protocol om dit te bereiken is verrassend eenvoudig, een korte incubatie van de cellen in een calciumchloride-oplossing. Deze incubatie zorgt ervoor dat de cellen doorlaatbaar worden voor DNA-moleculen. Nadat de cellen door centrifugatie zijn gepelleteerd, wordt het supernatant verwijderd. Het plasmide-DNA wordt nu toegevoegd aan de competente cellen. Na incubatie van de cellen met DNA, wordt het mengsel kort verwarmd tot 42 graden Celsius, gevolgd door snel afkoelen op ijs. Deze warmteschok zorgt ervoor dat het DNA over de celwand en membranen wordt overgebracht. De cellen worden vervolgens in vers medium geïncubeerd. Daarna worden de bacteriën op 37 graden geplaatst om hun membranen te laten herstellen en resistente eiwitten te gaan produceren.
De cellen die de plasmiden hebben opgenomen, zullen het DNA getrouw kopiëren en doorgeven aan hun nakomelingen en eventuele eiwitten gaan produceren die erdoor worden gecodeerd, inclusief genen voor antibioticaresistentie. Deze resistentiegenen kunnen worden gebruikt als selecteerbare markers om bacteriën te identificeren die succesvol zijn getransformeerd, omdat cellen die het plasmide niet hebben opgenomen, het resistentiegenproduct niet zullen produceren. Dit betekent dat wanneer de cellen worden uitgezaaid op een vast medium dat het juiste antibioticum bevat, alleen cellen die het plasmide hebben opgenomen, zullen groeien. Transformatie van de cellen in een groeiende kolonie kan verder worden bevestigd door die cellen in vloeibaar medium gedurende een nacht te kweken om de opbrengst te verhogen voordat het DNA uit het monster wordt geëxtraheerd. Zodra het DNA is geïsoleerd, kan een diagnostische restrictie-enzymdigest worden uitgevoerd. Omdat restrictie-enzymen DNA op voorspelbare locaties knippen, zou het uitvoeren van deze digests op een gel een voorspelbaar patroon moeten laten zien als het gewenste plasmide succesvol is getransformeerd. Bijvoorbeeld, als pUC19 wordt voorbereid en gesneden met het restrictie-enzym HindIII, zou er een enkele band van 2686 nucleotiden op het gel te zien moeten zijn.
In dit lab zul je E. coli-stam DH-5 Alpha transformeren met pUC19 en vervolgens de succesvolle transformatie bevestigen door DNA-gelelektroforese.
Voordat je met de procedure begint, moet je het juiste beschermingsmateriaal dragen, inclusief een laboratoriumjas en handschoenen. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol.
Bereidt nu chemisch competente cellen voor door een schroefdraad vol bacteriën op een steriele LB-agarplaat te deponeren en de bacteriën met een nieuwe schroefdraad uit te strijken. Bewaar de plaat vervolgens een nacht lang bij 37 graden Celsius. De volgende dag steriliseer je het werkoppervlak opnieuw met 70% ethanol en haal je de plaat uit de incubator.
Inoculeer een enkele, goed geïsoleerde kolonie in 3 milliliter LB-bouillon in een buis met een steriele schroefdraad. Kweek vervolgens de cultuur bij 37 graden Celsius gedurende een nacht, met schudden bij 210 RPM. De volgende dag meet je de optische dichtheid van de overnachtelijke cultuur met een spectrofotometer. Voeg vervolgens 100 milliliter LB-bouillon toe aan een literfles en inoculeer het met de overnachtelijke cultuur bij een optische dichtheid van 0,01. Kweek nu de cultuur bij 37 graden Celsius met schudden en controleer de OD600 elke 15 tot 20 minuten totdat de cultuur de midden-exponentiële groeifase bereikt.
Na ongeveer drie uur, breng je 50 milliliter van de cultuur over naar twee ijskoude polypropyleenflesjes. Plaats de flesjes vervolgens 20 minuten terug op ijs om af te koelen. Herstel vervolgens de cellen via centrifugatie. Gooi de supernatanten weg en plaats de flesjes ondersteboven op een papieren handdoek. Hersuspendeer vervolgens het bacteriële pellet in vijf milliliter ijskoud calciumchloride magnesiumchloride-oplossing en schudden voorzichtig totdat het pellet volledig is opgelost. Voeg vervolgens nog eens 25 milliliter van de oplossing toe aan het opgeloste bacteriële pellet. Hersuspendeer het andere bacteriële pellet zoals eerder aangetoond. Herhaal daarna de centrifugatie en gooi de supernatanten weg.
Als de competente cellen direct worden getransformeerd, hersuspendeer je elk bacterieel pellet in twee milliliter van een ijskoud 0,1 molair calciumchloride-oplossing door voorzichtig de buisjes te schudden. Om de transformatieprocedure te starten, breng je 50 microliter competente cellen over naar twee gelabelde 1,5 milliliter polypropyleenbuisjes. Voeg vervolgens een microliter pUC19-plasmide-DNA toe aan een van de buisjes. Meng voorzichtig, zonder luchtbellen te vormen, en incubeer beide buisjes 30 minuten op ijs. Na incubatie, breng je de buisjes over naar een warmteblok en incubeer je ze 45 seconden bij 42 graden Celsius. Breng de buisjes onmiddellijk over naar ijs en incubeer ze twee minuten. Voeg nu 950 microliter SOC-medium toe aan elke buis en incubeer ze een uur bij 37 graden Celsius om de bacteriën te laten herstellen en de antibioticaresistentiemarkering die in het plasmide is gecodeerd, tot expressie te brengen.
Om een 1 op 100 verdunning te maken, voeg je 990 microliter SOC-medium en 10 microliter celsuspensie toe aan een 1,5 milliliter buisje. Maak vervolgens een 1 op 10 verdunning door 900 microliter SOC-medium en 100 microliter celsuspensie toe te voegen aan een 1,5 milliliter buisje. Plateer vervolgens 100 microliter van de verdunde celsuspensies en 100 microliter van de negatie
