Conjugatie: Een methode om Ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger E. coli
Bron: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Afdeling Microbiologie, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Lab…
1. Set-Up
- Autoclaveer ongeveer 1L van Luria-Bertani medium (LB). Dit steriele LB zal worden gebruikt om ongeveer 5 mL LB te maken die 0,3 mM diaminopimelic zuur (DAP) bevat.
- Verzamel de volgende platen: LB agar platen met 1X Tet en 0,3 mM DAP, LB agar platen met alleen 1X Tet, en LB agar platen met alleen 1X Amp/Tet.
- Zorg ervoor dat wat glycerol en een doos voorgesteriliseerde plastic pipettentips bij de hand zijn.
- Voordat u begint met werk dat microben betreft, steriliseer de werkruimte met 70% ethanol. Draag altijd de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een labjas en handschoenen.
- Nadat u klaar bent, steriliseer alle oppervlakken en handschoenen met 70% ethanol en was uw handen.
2. Donor en receptor stamvoorbereiding
- Bereid 5 mL bacterieculturen van de donor- en receptorstammen voor en laat ze een nacht groeien bij 37 °C met beluchting en schudden bij 220 rpm. De donor stam moet worden gekweekt in LB met 0,3 mM DAP.
- Centrifugeer 1 mL van beide culturen (~3000 rpm gedurende 5 minuten) en was de cellen met PBS.
- Suspeneer de cellen in 500 μL fosfaat gebufferd zoutje (PBS).
3. Conjugatie
- Combineer 50 μL van de receptorcellen met 50 μL van de donorcellen in een microcentrifugebuisje en meng door te pipetteren.
- Incubeer het cellenmengsel gedurende 1 uur bij 37 °C. Dit zal de efficiëntie van conjugatie vóór en tijdens de volgende stap van plateren verbeteren.
- Pipet 100 μL van het cellenmengsel op een agarplaat met 1X Tet en 0,3 mM DAP. Verspreid niet op de plaat.
- Pipet 100 μL van de receptorcellencultuur op een agarplaat met 1X Tet en 0,3 mM DAP. Verspreid niet op de plaat.
- Incubeer beide platen een nacht bij 37 °C.
- Schraap het conjugatiecellenmengsel en de receptorcellencultuur op met een steriele cellenschraper. Breng de cellen over in een steriele microcentrifugebuis en suspendeer de cellen in 1 mL PBS.
- Vortex de cellen en centrifugeer ze voorzichtig (~3000 rpm gedurende 5 minuten).
- Suspendeer de cellen in 1 mL PBS.
- Plateer het conjugatiereactiecelmengsel op een LB agarplaat met alleen 1X Amp/Tet. Op deze plaat zullen alleen de receptorbacteriën die succesvol het Amp-resistentiegen via conjugatie hebben verkregen, verwacht worden om te groeien.
- Plateer de receptorcellen op een LB agarplaat met alleen 1X Tet. Op deze plaat zullen alleen ongeconjugeerde receptorbacteriën, die het Amp-resistentiegen niet hebben, verwacht worden om te groeien.
- Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
- Pluk enkele kolonies van beide platen en gebruik ze om overnachtsculturen te laten groeien in 5 mL medium (37 °C met beluchting bij 220 rpm).
4. DNA-isolatie
- Isoleer DNA van de eerder bereide culturen met behulp van 4,5 mL van het totale cultuurvolume door middel van DNA miniprep.
- Doe dit door het DNA te elueren met 35 μL nuclease-vrij water.
- Puur DNA zal een absorptieratio (A260/280) genereren van ongeveer 1,8.
- Gebruik de resterende 0,5 mL van elke cultuur om glycerolvoorraden te bereiden door een 1:1 mengsel van bacteriecultuur en 100% glycerol te maken.
- Bewaar de diepvriesvoorraden bij -80 °C.
5. Bevestiging van plasmide overdracht conjugatie door PCR
- Bereid twee PCR mastermixen voor, elk met een andere set voorwaartse en achterwaartse primers, een die een 500 basenpaarsegment binnen het ampicilline-resistentiegen target en de andere een segment binnen een housekeeping gen.
- Housekeeping genprimers werden ontworpen om een segment DNA te versterken binnen het bacteriële gen dat codeert voor DNA gyrase B (14).
- De volgende reagentiavolumes werden gebruikt om 90 μL van elke mastermix te bereiden:
7,5 μL van 10 μM voorwaartse primer
7,5 μL van 10 μM achterwaartse primer
75 μL van 2X PCR Master Mix
- Bereid de volgende zes PCR reacties voor met behulp van 15 μL mastermix, 10 ng van template DNA en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 25 μL.
Conjugatiereactie DNA en ampicillineprimers
Conjugatiereactie DNA en housekeepingprimers
Negatieve controle DNA en ampicillineprimers
Negatieve controle DNA en housekeepingprimers
Geen DNA en ampicillineprimers
Geen DNA en housekeepingprimers - Breng deze reacties over naar een PCR-apparaat met de blok voorverwarmd tot 98 °C en begin met thermocyclen onder de volgende omstandigheden:
98 °C gedurende 30 seconden
25-35 cycli van 98 °C gedurende 5-10 seconden, 45-72 °C gedurende 10 tot 30 seconden en 72 °C gedurende 15-30 seconden per kb
72 °C gedurende 5-10 minuten
Op 4 °C houden - Laad alle zes PCR reacties op een 1% agarosegel en laat deze ongeveer 20 minuten bij ~150V lopen.
- Visualiseer het PCR product met behulp van een UV verlichter.
Bacteriële cellen, zoals E. coli, kunnen genetische informatie van cel naar cel overdragen. Conjugatie verschilt van andere mechanismen van DNA-overdracht, zoals transductie of transformatie, omdat het fysiek contact tussen de cellen vereist.
Om door te gaan, vereist conjugatie een donorcel die de fertiliteit of F-factor tot uitdrukking brengt en een recipientcel zonder deze, een F minus cel. Het proces vereist twee stappen. De eerste is het tot stand brengen van directe cel-tot-cel contact. Om dit te doen, genereert de donorcel een extracellulaire filamenteuze structuur genaamd een sex pilus. Het is zo genoemd omdat conjugatie een vorm van paring is voor bacteriën die zich aseksueel voortplanten, maar het moet worden opgemerkt dat het geen ware seksuele voortplanting is aangezien er geen gameten worden uitgewisseld en er geen nakomelingen worden gevormd.
De tweede stap is de levering van DNA naar de recipientcel. Nadat de sex pilus contact heeft gemaakt tussen twee cellen, wordt een geleider genaamd het Type IV secretiesysteem gebouwd dat de overdracht van DNA mogelijk maakt. De donorcel begint vervolgens het extrachromosomale DNA te repliceren dat zal worden overgedragen, geselecteerd op basis van de aanwezigheid van een genetisch element dat bekend staat als de OriT of oorsprong van overdracht. Het ene uiteinde van het nieuw gerepliceerde DNA wordt door de geleider gevoerd door DNA-eiwitbinding. Terwijl het DNA verder wordt gerepliceerd, wordt het door de kanaal gepompt, gefaciliteerd door een complex van eiwitten gecodeerd door genen die zich dicht bij de OriT bevinden. Zodra het DNA volledig is overgedragen, zal het ofwel een extra chromosomaal plasmide vormen, of het kan zich integreren in het chromosoom van de recipientcel. Wat de eindpunten van het overgedragen DNA ook zijn, de genen die het codeert zullen dan worden tot expressie gebracht. Deze genexpressie kan worden gebruikt om succesvolle conjugatie te bevestigen.
Beschouw bijvoorbeeld een scenario waarin de donorstam ampicillineresistentie tot uitdrukking brengt en dit doorgeven in het geconjugeerde DNA aan de recipientbacterie, maar de recipientenstam heeft ook een tetracyclineresistentiegen dat niet in de donor aanwezig is. In dit geval, wanneer de cellen worden geplaat op LB-media die zowel tetracycline als ampicilline bevatten, zouden kolonies alleen moeten groeien uit succesvol geconjugeerde bacteriën, die beide resistentiefenomenen zullen uitdrukken. Om succesvolle conjugatie verder te bevestigen, kan plasmide-DNA van deze koloniën worden geoogst en vervolgens kan een sectie DNA specifiek voor het overgedragen plasmide worden geamplificeerd met behulp van polymerasekettingreactie of PCR. Wanneer het PCR-product wordt gedraaid op een elektroforese-gel naast een ladder van standaardgroottes, zou een PCR-fragment van een bekende grootte zichtbaar moeten zijn op de gel, wat verder de succesvolle conjugatie bevestigt. In dit experiment zal een plasmide worden gebruikt om het ampicillineresistentiegen via conjugatie over te dragen van een donorenstam naar een tetracycline-resistente recipientenstam. Hierna, om conjugatie te bevestigen, zal het conjugatiemengsel worden geïncubeerd op een plaat die beide antibiotica bevat, waardoor alleen de getransformeerde bacteriën overblijven. Ten slotte zal succesvolle conjugatie verder worden bevestigd met PCR.
Voordat u met de procedure begint, moet u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aantrekken, inclusief een laboratoriumjas en handschoenen. Vervolgens moet u het werkoppervlak steriliseren met 70% ethanol om het oppervlak af te vegen.
In deze procedure zal het ampicillineresistentiegen worden overgedragen van de WM3064-stam van E. coli naar de J53-stam van E. coli via conjugatie. De donorenstam WM3064 is resistent tegen tetracycline en ampicilline en vereist diaminopimelinezuur, of DAP, om te groeien. De recipientenstam J53 is alleen resistent tegen tetracycline en vereist geen DAP om te groeien. Dit betekent dat succesvol geconjugeerde cellen resistent moeten zijn tegen tetracycline en ampicilline en kunnen groeien zonder DAP.
Bereid de donorenstamcultuur voor door vijf milliliter LB met 0,3 millimol DAP te inoculeren met een stukje van de bevroren donorenstam glycerolvoorraad. Bereid vervolgens de recipientenstam voor door vijf milliliter LB-bouillon zonder DAP te inoculeren met een stukje van de bevroren recipientenstam glycerolvoorraad. Laat deze culturen een nacht groeien bij 37 graden Celsius met aëratie en schuddend bij 220 RPM in een schuddende incubator. Zodra de culturen zijn gegroeid tot een OD 600 van twee, verwijdert u één milliliter van elk de cultuur en plaatst u deze in twee nieuwe afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Centrifuge vervolgens deze aliquots gedurende vijf minuten bij 3000 RPM om de bacteriecellen te pelleten. Gooi het supernatant weg en was elk pellet met 250 microliter 1X PBS. Centrifugeer de monsters opnieuw en, na het weggooien van het supernatant, resuspendeert u elk pellet in 500 microliter PBS.
Om de conjugatieprocedure te beginnen, combineert u eerst 50 microliter recipientcellen met 50 microliter donorcellen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en mengt u door middel van piketten op en neer te gaan. Pipetteer vervolgens 100 microliter van de recipientcelcultuur op een andere 1X tetracyclineplaat met DAP. Bereid vervolgens uw negatieve controle voor door 100 microliter van de recipientcelcultuur alleen op een niet-selectieve agarplaat met DAP te pipetteren. Bewaar vervolgens de conjugatie- en negatieve controleplaten een nacht bij 37 graden Celsius.
De volgende dag, neemt u een steriele celschraper en haalt u cellen van de conjugatieplaat door kolonies te verzamelen. Breng vervolgens de koloniën over naar een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met één milliliter 1X PBS. Herhaal dit proces om de recipientcellen van de andere plaat te verzamelen.
Na dit, schudt u de monsters om te mengen. Na het mengen, brengt u de buisjes over naar een centrifuge om de cellen voorzichtig te pelleten. Gooi het supernatant weg en was de cellen in één milliliter PBS en schud de buisjes om de cellen te resuspenderen. Pellet de cellen opnieuw door te centrifugeren. Gooi opnieuw het supernatant weg en resuspendeert u beide cellenpellets in één milliliter PBS. Plaats nu, met behulp van een steriele pipettentip, 100 microliter van het conjugatiereactiecellixt op een LB-agarplaat zonder DAP die
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the sex pilus and what role does it play in bacterial conjugation?
The sex pilus is an extracellular filamentous structure generated by the donor cell to establish direct cell-to-cell contact with the recipient cell. This physical contact is essential for conjugation to proceed. The sex pilus is encoded by the F (fertility) factor and serves as the initial bridge between donor and recipient cells before DNA transfer begins.
Q2: How does the Type IV secretion system facilitate DNA transfer during conjugation?
After the sex pilus establishes contact, a conduit called the Type IV secretion system is built between the two cells. This multiprotein complex allows DNA to be actively transported from the donor to the recipient. The system works with coupling proteins to pump replicated DNA through the channel, enabling the transfer of genetic material encoding traits like ampicillin resistance.
Q3: Why is selective plating used to confirm successful conjugation in this experiment?
Selective plating uses antibiotics to isolate only successfully conjugated cells. The donor strain requires diaminopimelic acid (DAP) to survive, while the recipient lacks ampicillin resistance. Plating on media with both tetracycline and ampicillin without DAP eliminates donor cells and non-conjugated recipients, leaving only recipient cells that acquired ampicillin resistance through conjugation.
Q4: What is the origin of transfer (OriT) and why is it important for conjugation?
The origin of transfer (OriT) is a genetic element on the plasmid that signals where DNA replication and transfer should begin. A relaxase enzyme cleaves at the nic site within the OriT sequence and covalently attaches to the DNA strand, initiating the formation of the relaxosome complex. This complex is essential for directing which DNA gets replicated and transferred to the recipient cell.
Q5: How does PCR confirm the successful transfer of ampicillin resistance genes?
PCR amplifies a specific DNA sequence from the transferred plasmid using primers designed for the ampicillin resistance gene. Successfully conjugated cells contain this gene and produce a visible band of known size on an agarose gel. A housekeeping gene serves as a positive control, while recipient-only DNA should show no amplification, confirming the resistance gene was successfully transferred.
Q6: How does conjugation differ from other bacterial DNA transfer mechanisms?
Conjugation requires direct physical contact between donor and recipient cells through the sex pilus, unlike transduction or transformation. It is unidirectional, with DNA flowing from donor to recipient, and naturally occurs in bacteria. This process has contributed to the spread of antibiotic resistance and can be manipulated in laboratory settings using selective pressures for horizontal gene transfer.
Q7: What happens to transferred DNA once it enters the recipient cell?
Once transferred, the DNA can either form an extrachromosomal plasmid or integrate into the recipient cell's chromosome. Regardless of its final location, the genes encoded on the transferred DNA are then expressed in the recipient cell. This gene expression produces the new phenotype, such as ampicillin resistance, which can be detected through selective plating or PCR analysis.