Conjugatie: Een methode om Ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger E. coli

1. Set-Up

1. Autoclaveer ongeveer 1L van Luria-Bertani medium (LB). Dit steriele LB zal worden gebruikt om ongeveer 5 mL LB te maken die 0,3 mM diaminopimelic zuur (DAP) bevat.
2. Verzamel de volgende platen: LB agar platen met 1X Tet en 0,3 mM DAP, LB agar platen met alleen 1X Tet, en LB agar platen met alleen 1X Amp/Tet.
3. Zorg ervoor dat wat glycerol en een doos voorgesteriliseerde plastic pipettentips bij de hand zijn.
4. Voordat u begint met werk dat microben betreft, steriliseer de werkruimte met 70% ethanol. Draag altijd de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een labjas en handschoenen.
5. Nadat u klaar bent, steriliseer alle oppervlakken en handschoenen met 70% ethanol en was uw handen.

2. Donor en receptor stamvoorbereiding

1. Bereid 5 mL bacterieculturen van de donor- en receptorstammen voor en laat ze een nacht groeien bij 37 °C met beluchting en schudden bij 220 rpm. De donor stam moet worden gekweekt in LB met 0,3 mM DAP.
2. Centrifugeer 1 mL van beide culturen (~3000 rpm gedurende 5 minuten) en was de cellen met PBS.
3. Suspeneer de cellen in 500 μL fosfaat gebufferd zoutje (PBS).

3. Conjugatie

1. Combineer 50 μL van de receptorcellen met 50 μL van de donorcellen in een microcentrifugebuisje en meng door te pipetteren.
2. Incubeer het cellenmengsel gedurende 1 uur bij 37 °C. Dit zal de efficiëntie van conjugatie vóór en tijdens de volgende stap van plateren verbeteren.
3. Pipet 100 μL van het cellenmengsel op een agarplaat met 1X Tet en 0,3 mM DAP. Verspreid niet op de plaat.
4. Pipet 100 μL van de receptorcellencultuur op een agarplaat met 1X Tet en 0,3 mM DAP. Verspreid niet op de plaat.
5. Incubeer beide platen een nacht bij 37 °C.
6. Schraap het conjugatiecellenmengsel en de receptorcellencultuur op met een steriele cellenschraper. Breng de cellen over in een steriele microcentrifugebuis en suspendeer de cellen in 1 mL PBS.
7. Vortex de cellen en centrifugeer ze voorzichtig (~3000 rpm gedurende 5 minuten).
8. Suspendeer de cellen in 1 mL PBS.
9. Plateer het conjugatiereactiecelmengsel op een LB agarplaat met alleen 1X Amp/Tet. Op deze plaat zullen alleen de receptorbacteriën die succesvol het Amp-resistentiegen via conjugatie hebben verkregen, verwacht worden om te groeien.
10. Plateer de receptorcellen op een LB agarplaat met alleen 1X Tet. Op deze plaat zullen alleen ongeconjugeerde receptorbacteriën, die het Amp-resistentiegen niet hebben, verwacht worden om te groeien.
11. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
12. Pluk enkele kolonies van beide platen en gebruik ze om overnachtsculturen te laten groeien in 5 mL medium (37 °C met beluchting bij 220 rpm).

4. DNA-isolatie

1. Isoleer DNA van de eerder bereide culturen met behulp van 4,5 mL van het totale cultuurvolume door middel van DNA miniprep.
2. Doe dit door het DNA te elueren met 35 μL nuclease-vrij water.
3. Puur DNA zal een absorptieratio (A_260/280) genereren van ongeveer 1,8.
4. Gebruik de resterende 0,5 mL van elke cultuur om glycerolvoorraden te bereiden door een 1:1 mengsel van bacteriecultuur en 100% glycerol te maken.
5. Bewaar de diepvriesvoorraden bij -80 °C.

5. Bevestiging van plasmide overdracht conjugatie door PCR

1. Bereid twee PCR mastermixen voor, elk met een andere set voorwaartse en achterwaartse primers, een die een 500 basenpaarsegment binnen het ampicilline-resistentiegen target en de andere een segment binnen een housekeeping gen.
   1. Housekeeping genprimers werden ontworpen om een segment DNA te versterken binnen het bacteriële gen dat codeert voor DNA gyrase B (14).
   2. De volgende reagentiavolumes werden gebruikt om 90 μL van elke mastermix te bereiden:
      7,5 μL van 10 μM voorwaartse primer
      7,5 μL van 10 μM achterwaartse primer
      75 μL van 2X PCR Master Mix
2. Bereid de volgende zes PCR reacties voor met behulp van 15 μL mastermix, 10 ng van template DNA en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 25 μL.
   Conjugatiereactie DNA en ampicillineprimers
   Conjugatiereactie DNA en housekeepingprimers
   Negatieve controle DNA en ampicillineprimers
   Negatieve controle DNA en housekeepingprimers
   Geen DNA en ampicillineprimers
   Geen DNA en housekeepingprimers
3. Breng deze reacties over naar een PCR-apparaat met de blok voorverwarmd tot 98 °C en begin met thermocyclen onder de volgende omstandigheden:
   98 °C gedurende 30 seconden
   25-35 cycli van 98 °C gedurende 5-10 seconden, 45-72 °C gedurende 10 tot 30 seconden en 72 °C gedurende 15-30 seconden per kb
   72 °C gedurende 5-10 minuten
   Op 4 °C houden
4. Laad alle zes PCR reacties op een 1% agarosegel en laat deze ongeveer 20 minuten bij ~150V lopen.
5. Visualiseer het PCR product met behulp van een UV verlichter.