Fagen-transductie: een methode om ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger E. coli
Bron: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases…
1. Opzetten
- Voordat u begint met elk werk dat microben betreft, steriliseert u de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik altijd de noodzakelijke PPL (labcoat en handschoenen).
- Zorg ervoor dat LB-agarplaten met 1x ampicilline, commercieel verkrijgbare P1-fagelyoseetoplossing, chloroform, 1 M natriumcitraat, glycerol en een doos voorgesteriliseerde plastic pipettenpunten en celverspreiders binnen handbereik zijn.
- Bereid steriel LB voor door autoclavage en gebruik het om drie 1 mL aliquoten van LB-zout oplossing te maken.
- mM MgCl2 (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl2 (11,098 mg), 0,1-0,2% glucose (100-200 μg)
- mM MgSO4 (12,0366 mg), 5 mM CaCl2 (11,098 mg)
- mM natriumcitraat (25,806 mg)
- Nadat u klaar bent, steriliseert u alle oppervlakken evenals handschoenen met 70% ethanol en wast u uw handen.
2. Protocol
- Bereiding van donorfagelyoseet
- Bereid een 1 mL cultuur van donor W3110 stam E. coli in LB met 1x ampicilline die overnacht bij 37 °C is gekweekt met beluchting en geschud bij 220 rpm.
- Verdun deze overnacht cultuur 1:100 in 1 mL verse LB aangevuld met 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 en 0,1-0,2% glucose.
- Laat deze bacteriële verdunning groeien bij 37 °C gedurende 2 uur met beluchting en geschud bij 220 rpm.
- Zodra deze cellen de vroege logaritmische groeifase hebben bereikt (merkbare groei en lichte troebelheid), voeg 40 μL commercieel verkrijgbaar P1-fagel toe en laat het bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm staan.
- Voor de fageltoevoeging moet de gemeten optische dichtheid bij 600 nm van deze cellen ongeveer 0,4 zijn (6).
- Bewaak de cellen gedurende 1-3 uur totdat de cultuur is gelyseerd.
- Lyse zal resulteren in verhoogd cellulair puin en een opvallende afname in troebelheid (d.w.z. cellen worden beschouwd als gelyseerd zodra men door de cultuur kan zien).
- Voeg verschillende druppels (50-100 μL) chloroform toe aan het lyseet en meng door te vortexen.
- Chloroform steriliseert het fagelyoseet door alle resterende donorcellen te doden, waardoor alleen fagel en een verhoging van de titer van dit lyseet achterblijven.
- Centrifugeer lyseet bij 14.000 rpm gedurende 2 minuten om puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een nieuwe buis.
- Voeg een paar druppels chloroform toe en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal één dag.
- Transductie
- Bereid een 1 mL cultuur van receptor J53 stam E. coli die overnacht is gekweekt in LB bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm.
- Breng 100 μL donorfagelyoseet (2.1) over in een 1,5 mL microfugebuis en incubeer met open dop bij 37 °C gedurende 30 minuten.
- Deze incubatie zorgt ervoor dat eventueel overgebleven chloroform in de P1-lyseeoplossing kan verdampen voordat het aan de receptorcellen wordt toegevoegd.
- Pellet de cellen van de receptorstam voorzichtig door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer deze cellen in 300 μL verse LB bevattende 100 mM MgSO4 en 5 mM CaCl2. (P1-fagel vereist calcium om besmettelijk te zijn).
- Stel twee reacties in met behulp van de receptorbacteriecellen en het bereide donorfagelyoseet: 1) transductiereactie die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL donorfagelyoseet, en 2) negatieve controle die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL LB bevattende 100 mM MgSO4 en 5 mM CaCl2.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met schudbeweging bij 220 rpm.
- Voeg 1 mL LB en 200 μL 1M natriumcitraat (pH=5,5) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met schudbeweging bij 220 rpm.
- Citraat wordt gebruikt om de besmettelijkheid van P1 te verminderen door chelatisering met calcium, waardoor de lyse van de receptorbacteriën wordt voorkomen.
- Incubatie van deze oplossing zorgt voor de expressie van het ampicilline-resistentiemarker.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de celpellets in 100 μL LB met 100 mM natriumcitraat (pH 5,5). Vortex en plateer de volledige oplossing voor beide reacties op twee LB-agarplaten.
- LB-plaat moet 1x Amp hebben voor het getransduceerde monster en geen Amp voor de negatieve controle.
- P1-fagelcontamina
Bacteriën kunnen zich snel aanpassen aan een snel veranderende omgeving door genetisch materiaal uit te wisselen en een manier om dit te doen is via transductie, de uitwisseling van genetisch materiaal gemedieerd door bacteriële virussen. Een bacteriofaag, vaak afgekort tot faag, is een type virus dat bacteriën infecteert door zich eerst aan het oppervlak van de gastheer te hechten en vervolgens zijn DNA in de bacteriële cel te injecteren. Vervolgens degradeert het de eigen DNA van de gastheercel en repliceert zijn virale genoom, terwijl het de machinerie van de cel kapt om veel kopieën van zijn eiwitten te synthetiseren. Deze fage-eiwitten verzamelen zichzelf en verpakken de fage-genomen om meerdere nakomelingen te vormen. Echter, vanwege de lage trouw van het DNA-verpakkingsmechanisme, verpakt de faag af en toe fragmenten van bacterieel DNA in de faag-capsiden. Na het induceren van de lysis van de gastheer, worden de faagnakomelingen vrijgelaten en wanneer zo'n faag een andere gastheercel infecteert, brengt hij het DNA-fragment van zijn vorige gastheer over. Dit kan dan recombineren en permanent worden geïncorporeerd in het chromosoom van de nieuwe gastheer, waardoor genoverdracht tussen de twee bacteriën wordt gemedieerd.
Om faagtransductie in het laboratorium uit te voeren, is een donorstam nodig die een gen van belang bevat, een ontvangerstam die het niet heeft, een faag die beide stammen kan infecteren en een methode om de getransduceerde bacteriën te selecteren. In de meeste gevallen zal dit een selectief vast groeimedium zijn dat de groei van getransduceerde bacteriën ondersteunt, maar de groei van niet-getransduceerde bacteriën remt. Om te beginnen wordt de donor-stam die het gen van belang bevat gekweekt in een vloeibaar groeimedium. Wanneer alle bacteriën actief delen in de logfase van hun groei, wordt de cultuur geïnoculeerd met de doelfaag. Na drie tot vier uur incubatie, wanneer bijna alle bacteriën zijn gelyseerd en de faagdeeltjes hebben vrijgegeven, wordt het donorfaaglysaat geïnoculeerd in een vers gekweekte cultuur van de ontvanger-bacteriestam. Na een korte incubatie van een uur, zou de cultuur nu een mengsel van getransduceerde en niet-getransduceerde bacteriecellen moeten bevatten en dit wordt gescreend op de getransduceerde cellen door een fractie van de suspensie te verspreiden op een geschikt selectief vast groeimedium. Bij verdere incubatie zouden de getransduceerde cellen moeten groeien en zich vermenigvuldigen om zichtbare kolonies te vormen. Deze kolonies kunnen vervolgens worden geselecteerd voor verdere analyse met behulp van verschillende methoden om een succesvolle transductie verder te bevestigen, zoals kolonie-PCR, DNA-sequencing of kwantitatieve PCR.
Voordat u met de procedure begint, draagt u alle geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een laboratoriumjas en handschoenen. Steriliseer vervolgens de werkruimte met 70% ethanol en veeg het oppervlak schoon.
Bereidt vervolgens drie een-milliliter aliquots van LB-zout-oplossing. Bereid nu een donor-stam-cultuur door 100 microliters E. coli toe te voegen aan een 15 milliliter conische flacon met vijf milliliter LB-groeimedium met 500 microgram ampicilline. Laat vervolgens de cultuur overnacht groeien bij 37 graden Celsius met beluchting en schuddend op 220 rpm. De volgende dag veegt u het werkblad schoon met 70% ethanol voordat u de cultuur uit de schuddende incubator verwijdert. Verdun vervolgens de overnachtelijke cultuur een op honderd door 10 microliters donor-stam toe te voegen aan 990 microliters vers LB aangevuld met zout-oplossing.
Laat de bacteriële verdunning twee uur groeien bij 37 graden Celsius met beluchting en schuddend op 220 rpm. Zodra de cellen de vroege log-fase hebben bereikt, verwijdert u de cultuur uit de incubator, voegt u 40 microliters P1-faag toe aan de cultuur en incubeert u opnieuw. Blijf de cellen één tot drie uur monitoren totdat de cultuur is gelyseerd. Voeg vervolgens 50 tot 100 microliters chloroform toe aan het lysaat en meng door te vortexen. Centrifugeer vervolgens het lysaat om puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een verse buis. Voeg een paar druppels chloroform toe aan de supernatant en bewaar deze niet langer dan één dag bij vier graden Celsius.
Om de transductieprocedure te beginnen, verkrijgt u een een-milliliter-cultuur van de ontvanger-stam. Breng vervolgens 100 microliters donor-faaglysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer deze bij 37 graden Celsius met de dop open gedurende 30 minuten om eventueel aanwezig chloroform te laten verdampen. Terwijl het donor-faaglysaat incubeert, peletteert u de ontvanger-stam-cellen via zachte centrifugatie. Gooi de supernatant weg en resuspendeer het cellenpelletje in 300 microliters vers LB bevattend 100 millimolar magnesiumsulfaat en vijf millimolar calciumchloride.
Stel vervolgens de transductiereactie in door 100 microliters van de ontvanger-stam en 100 microliters van het donor-faaglysaat te combineren in een microcentrifugebuis. Stel vervolgens de negatieve controle in door 100 microliters van de ontvanger-stam en 100 microliters LB met magnesiumsulfaat en calciumchloride te combineren. Na incubatie voegt u 200 microliters van een molaire natriumcitraat-oplossing en een milliliter LB toe aan beide buisjes en mengt u door voorzichtig op en neer te pipetteren. Nadat de buisjes een uur zijn geïncubeerd, peletteert u de cellen voorzichtig door centrifugatie.
Na centrifugatie gooit u de supernatant weg en resuspendeert u de gepeletteerde cellen in 100 microliters LB met 100 millimolar natriumcitraat. Vortex de oplossingen en pipet de gehele getransduceerde monster op een LB-agarplaat met 1X ampicilline. Pipet tenslotte de volledige inhoud van het negatieve controle-cellenmengsel op een LB-agarplaat zonder ampicilline. Na het incuberen van de platen overnacht bij 37 graden Celsius, gebruikt u een steriele pipetpunt om drie tot vier kolonies van de transductieplaat te plukken en deze uit te strekken op een nieuwe LB-agarplaat bevattend 1X ampicilline en 100 microliters van een molaire natriumcitra
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.