Fagen-transductie: een methode om ampicilline-resistentie over te brengen van donor naar ontvanger E. coli

1. Opzetten

1. Voordat u begint met elk werk dat microben betreft, steriliseert u de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik altijd de noodzakelijke PPL (labcoat en handschoenen).
2. Zorg ervoor dat LB-agarplaten met 1x ampicilline, commercieel verkrijgbare P1-fagelyoseetoplossing, chloroform, 1 M natriumcitraat, glycerol en een doos voorgesteriliseerde plastic pipettenpunten en celverspreiders binnen handbereik zijn.
3. Bereid steriel LB voor door autoclavage en gebruik het om drie 1 mL aliquoten van LB-zout oplossing te maken.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2% glucose (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. mM natriumcitraat (25,806 mg)
4. Nadat u klaar bent, steriliseert u alle oppervlakken evenals handschoenen met 70% ethanol en wast u uw handen.

2. Protocol

1. Bereiding van donorfagelyoseet
   1. Bereid een 1 mL cultuur van donor W3110 stam E. coli in LB met 1x ampicilline die overnacht bij 37 °C is gekweekt met beluchting en geschud bij 220 rpm.
   2. Verdun deze overnacht cultuur 1:100 in 1 mL verse LB aangevuld met 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂ en 0,1-0,2% glucose.
   3. Laat deze bacteriële verdunning groeien bij 37 °C gedurende 2 uur met beluchting en geschud bij 220 rpm.
   4. Zodra deze cellen de vroege logaritmische groeifase hebben bereikt (merkbare groei en lichte troebelheid), voeg 40 μL commercieel verkrijgbaar P1-fagel toe en laat het bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm staan.
      1. Voor de fageltoevoeging moet de gemeten optische dichtheid bij 600 nm van deze cellen ongeveer 0,4 zijn (6).
   5. Bewaak de cellen gedurende 1-3 uur totdat de cultuur is gelyseerd.
      1. Lyse zal resulteren in verhoogd cellulair puin en een opvallende afname in troebelheid (d.w.z. cellen worden beschouwd als gelyseerd zodra men door de cultuur kan zien).
   6. Voeg verschillende druppels (50-100 μL) chloroform toe aan het lyseet en meng door te vortexen.
      1. Chloroform steriliseert het fagelyoseet door alle resterende donorcellen te doden, waardoor alleen fagel en een verhoging van de titer van dit lyseet achterblijven.
   7. Centrifugeer lyseet bij 14.000 rpm gedurende 2 minuten om puin te verwijderen en breng de supernatant over naar een nieuwe buis.
   8. Voeg een paar druppels chloroform toe en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal één dag.
2. Transductie
   1. Bereid een 1 mL cultuur van receptor J53 stam E. coli die overnacht is gekweekt in LB bij 37 °C met beluchting en geschud bij 220 rpm.
   2. Breng 100 μL donorfagelyoseet (2.1) over in een 1,5 mL microfugebuis en incubeer met open dop bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      1. Deze incubatie zorgt ervoor dat eventueel overgebleven chloroform in de P1-lyseeoplossing kan verdampen voordat het aan de receptorcellen wordt toegevoegd.
   3. Pellet de cellen van de receptorstam voorzichtig door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.
   4. Resuspendeer deze cellen in 300 μL verse LB bevattende 100 mM MgSO₄ en 5 mM CaCl₂. (P1-fagel vereist calcium om besmettelijk te zijn).
   5. Stel twee reacties in met behulp van de receptorbacteriecellen en het bereide donorfagelyoseet: 1) transductiereactie die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL donorfagelyoseet, en 2) negatieve controle die 100 μL receptor J53 stam E. coli combineert met 100 μL LB bevattende 100 mM MgSO₄ en 5 mM CaCl₂.
   6. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met schudbeweging bij 220 rpm.
   7. Voeg 1 mL LB en 200 μL 1M natriumcitraat (pH=5,5) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met schudbeweging bij 220 rpm.
      1. Citraat wordt gebruikt om de besmettelijkheid van P1 te verminderen door chelatisering met calcium, waardoor de lyse van de receptorbacteriën wordt voorkomen.
      2. Incubatie van deze oplossing zorgt voor de expressie van het ampicilline-resistentiemarker.
   8. Pellet cellen door centrifugatie bij 6.000 rpm gedurende 5 minuten.
   9. Resuspendeer de celpellets in 100 μL LB met 100 mM natriumcitraat (pH 5,5). Vortex en plateer de volledige oplossing voor beide reacties op twee LB-agarplaten.
      1. LB-plaat moet 1x Amp hebben voor het getransduceerde monster en geen Amp voor de negatieve controle.
      2. P1-fagelcontamina