Name: Horizontale Snijd Voorbereiding van de Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer een nieuwe snijtechniek voor retinale neuronen die dendritische morfologie behoudt. Deze methode biedt betrouwbaardere resultaten dan traditionele verticale sneden voor visuele circuitstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Richard H. Masland en Akimichi Kaneko voor het geven van ons waardevolle adviezen en suggesties om de procedure van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies vast te stellen.

<ol><li> Bereid een agar blok (30 mg / ml, dat wil zeggen 3%, in gedestilleerd water). Ontbinden en magnetron het eerst en giet het in een glazen schaaltje. Hou de schotel in de koelkast bij 4 ° C. Tip: De agar blok moet worden voorbereid op voorhand. </li><li> Bereid lage temperatuur smeltende agarose gel (25 mg / ml, dat wil zeggen 2,5%, in medium). Ontbinden en magnetron het. Houd het in het hete waterbad bij 35 ° C. Tip: Houd de agarosegel niet te heet. Als het te warm is, duurt het een lange tijd te zijn gestold, en de gel kan doden het netvlies . </li><li> Euthanaseren het dier, ophelderen een oogbol en open het als een oogschelp. Naar vloeibaar glasvocht, is de geopende oogschelp geweekt gedurende 10 min. in hyaluronidase in het medium (0,07 mg / ml), indien noodzakelijk. </li><li> Snijd de agar in een blok (bijv. 1 cm x 1,5 cm voor muis netvlies) en stevig bevestigd op een vibratome stadium door onmiddellijke lijm. Houd de agar blok nat. </li><li> Plaats het mes bij 5 graden op de snijmachine. Voorzichtig snijd de bovenkant van de agar blok met de snelheid van ca. 50 pm / sec, freq. 50 Hz. Tip: Zorg ervoor dat de bovenkant van de agar blok is helemaal glad en plat. Verschillende sneden (minstens 3 keer) kan nodig zijn om de gladde en vlakke oppervlak van de agar blok te krijgen. </li><li> Spoel de oogschelp met het medium zonder hyaluronidase. Isoleer het netvlies van een pigment epitheel en plaats het fotoreceptor-kant naar beneden op een stuk filtreerpapier. Stevig het netvlies hechten aan het filterpapier, vacuüm het netvlies op de filtreerpapier meerdere malen. Tip: Zorg ervoor dat het netvlies is verbonden aan de filtreerpapier volledig plat. Nadat je een netvlies op het filter papier, knip de overtollige filtreerpapier rond het netvlies (fig. 2a). De overmaat filter papier voorkomt vaak een mes uit te gaan in de juiste laag van het netvlies. </li><li> Veeg de overtollige medium op de agar blok en zorgvuldig het netvlies plaats op de filter papier op de agar te blokkeren. Stevig plaatsen van de filter papier op de agar te blokkeren, sluit direct lijm op de rand van het filter papier. Tip: Om te voorkomen dat unexpectable kraken, het netvlies plaats vooraan als mogelijk op de bovenkant van de agar te blokkeren. </li><li> Giet de lage-temperatuur-smeltend agarose gel over het netvlies. Wacht op 1 min en voorzichtig het medium giet er op om af te koelen. De agarosegel wordt al snel gestold. Tip: Te heet agarosegel doodt het netvlies. </li><li> Til het blad staat tot enkele honderden micrometer boven de oppervlakte van de agar blok en zachtjes snijd de bovenkant van het gestolde agarose gel. </li><li> Lager het blad positie. Snijd het netvlies op het niveau van de proximale een derde van de binnenste nucleaire laag (ongeveer tussen 200 en 250 micrometer boven de oppervlakte van de agar blok). Tip: Te veel snelheid van het mes schade zal toebrengen aan het netvlies ernstig. Ca. 50 micrometer / sec (50 Hz) geschikt is. </li><li> Merk op dat de amacrine cellen zijn nu naar beneden. Voorzichtig pak je de plak van het netvlies, samen met de gestolde agarose gel en plaats deze zijde naar boven in een kamer of een schotel. Tip: Omdat de muis netvlies is klein en golvend, is het moeilijk om een perfecte horizontale slice te verkrijgen op een juiste laag. Een &quot;schuin&quot; slice kan een alternatieve methode om de relatieve vlakke deel van het netvlies te krijgen. Om de schuine stuk, zet een ander filtreerpapier tussen het netvlies op het filter papier en de agar blok zoals weergegeven in Fig.2B. Hoewel je kunt niet verwachten dat een perfect horizontale slice, er zijn altijd enkele gebieden waar amacrine cel soma is op het oppervlak van de slice. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

Alle experimentele protocollen werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health richtlijnen voor het gebruik van dieren.

Er zijn een aantal belangrijke voordelen van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies. Eerste, is de morfologie van de cellen die dendrieten uit te breiden horizontaal, zoals amacrine cellen en horizontale cellen, bewaard gebleven. Het is aangetoond dat er meer dan 20 soorten amacrine cellen in het netvlies (MacNeil en Masland, 1998), zodat het is heel belangrijk voor de morfologie van de cellen te vergelijken met de fysiologische eigenschap. Ten tweede, in de hele-mount netvlies, de uitgebreide dekking van endfeet...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>Agarose L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>Agarose met laag smeltpunt</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Type I-S, 300 U/mg</td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td>in mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, en 10 glucose, bij een pH van 7,8, of Ames&amp;rsquo;-oplossing (Sigma)</td></tr><tr><td>Magnetron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warmtebad</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Vibratoom-snijapparaat</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>MF-membraanfilters</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>Filterpapier, poriegrootte 0,45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>Dissectie-instrumenten</td><td></td><td></td><td>pincetten, mesje, klemmetje, &lt;em&gt;etc&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>Snellijm</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;bijv.&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>50 mL spuit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale snijd voorbereiding van de retina

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. Echter, veel van retinale neuronen, zoals amacrine cellen, horizontaal uit te breiden hun dendrieten, zodat de morfologie van de cellen wordt verondersteld te zwaar beschadigd in de verticale plakjes. In de hele-mount voorbereiding, in het bijzonder voor patch-clamp opnames, retinale neuronen in de middelste laag zijn niet gemakkelijk toegankelijk zijn als gevolg van de uitgebreide dekking van de glia cel (Mueller cel) s endfeets. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden. De slice is horizontaal gemaakt op de binnenste laag van het netvlies met behulp van een vibratome slicer na het netvlies was ingebed in de lage temperatuur smeltende agarosegel. In deze horizontale plak de voorbereiding van het netvlies, bestudeerden we de functie van retinale neuronen in vergelijking met hun morfologie, met behulp van patch-clamp-opname, calcium beeldvormende techniek, immunocytochemie, en single-cell RT-PCR.

Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden.

Horizontale Snijd Voorbereiding van de Retina

Traditioneel zijn de verticale doorsnede en de whole-mount preparatie van het netvlies gebruikt om de functie van netvliescircuits te bestuderen. Echter, veel van ...

Dus de legendarische is hier, en dit is een preprint.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De niet-menselijke primaat is een belangrijk translationeel soort voor ons begrip van de ontwikkeling en veroudering. De anatomische organisatie van het primaat netvlies kan leveren belangrijke inzichten in normale en pathologische omstandigheden bij de mens.

De poort naar de hersenen: Ontrafeling van de Primate Eye

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Imaging retinale weefsel kan informeren eencellige die niet kunnen worden verzameld van traditionele biochemische methoden. Dit protocol beschrijft voorbereiding van retinale segmenten van zebravis confocal imaging. Fluorescerende genetisch gecodeerd sensoren of indicator kleurstoffen toestaan visualisatie van tal van biologische processen in verschillende retinale celtypes.

Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer een nieuwe snijtechniek voor retinale neuronen die dendritische morfologie behoudt. Deze methode biedt betrouwbaardere resultaten dan traditionele verticale sneden voor visuele circuitstudies.

Horizontale Snijd Voorbereiding van de Retina

Meer video's verkennen