Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics
February 18th, 2009
We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.
Deze procedure begint met de verwerving van mariene microbiële biomassa uit watermonsters door pre-filtratie door vijf en drie micrometerfilters, gevolgd door verzameling op een 0,22 micrometerfilter. Totaal RNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit de organismen die op het 0,22 micrometerfilter zijn vastgehouden. Ons RNA wordt verwijderd uit het totale RNA door selectieve enzymatische degradatie en subtractieve hybridisatie verrijkt Mr.N wordt lineair versterkt via polyA-staartvorming en in vitro transcriptie.
Het versterkte antisense RNA wordt vervolgens omgezet in dubbelstrengs CD NA met behulp van willekeurige hexameren. Het resulterende CD NA kan worden gekloond en gesequenced of direct pyro gesequenced. Hoi, ik ben Rachel Persky van het laboratorium van Dr. Marianne Moran bij het Department of Marine Sciences van de Universiteit van Georgia.
Vandaag laten we je een procedure zien voor het bekijken van genexpressie uit omgevingsmonsters. Met behulp van omgevingsmeta transcriptomics. Scott Gifford laat je zien hoe je omgevingsmonsters verwerkt voor RNA-verzameling.
Ik zal je laten zien hoe je RNA uit de monsters en Johanna RINs extraheert. AON zal RNA-verwijdering demonstreren. Maria Kosta zal vervolgens de RNA-versterking en CD NA-synthese stappen doorlopen.
Dus laten we beginnen. Om de omgevings-RNA-verzameling te starten, zetten we het filterlijnsysteem op door het ene uiteinde van de slang in het water op de gewenste diepte voor bemonstering te plaatsen en het andere uiteinde aan te sluiten op een hoogvolume drie micrometerfilter en de pomp tussen de twee uiteinden van de slang te plaatsen. Het drie micrometerfilter wordt vervolgens verbonden met de 0,22 micrometerfiltertoren en het uitstroom wordt van de 0,22 micrometertoren in een gemeten cargo geleid.
Laat vervolgens enkele liters water door het systeem lopen om te spoelen. Wanneer je klaar bent, verwijder je de slang uit het water terwijl de pomp draait om het resterende water uit de leiding te verdrijven. Gebruik vervolgens een tang om een 0,22 micrometerfilter op de filtertoren te plaatsen en sluit deze.
Plaats het uiteinde van de leiding terug in het water en zet de pomp aan. Laat de lucht uit beide filters purgen en controleer het volume water dat is gefilterd met de op de carboy. Zodra het gewenste volume is gefilterd, verwijder je de leiding uit het water en purge de resterende water uit het systeem.
Zodra de filter droog is, verwijder je snel de bovenste filterplaat en vouw je het filterpapier. Plaats de filter in een draaimolen en snap-vries in vloeibare stikstof. Voordat we met het experiment beginnen, is het belangrijk op te merken dat omdat RNA's alomtegenwoordig zijn en mRNA's snel degraderen, standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken in een ribonuclease-vrije omgeving moeten worden gevolgd, inclusief werkoppervlakken en pipetten.
Met dit in gedachten, moeten schone handschoenen worden gedragen bij het hanteren van alle materialen die in deze procedure worden gebruikt. En monsters moeten zo kort mogelijk worden verwerkt. Om de totale RNA-extractie van de 0,22 micrometerfilter te starten, bereiden we bead beadingbuizen voor door acht milliliter RLT-buffer toe te voegen met beta meto ethanol toegevoegd aan een 50 milliliter conische buis.
Vervolgens worden een tot twee milliliter RNA-kralen van een mobiele power soil extractiekit toegevoegd. Verwijder snel de bevroren filter uit de vriezer en houd het in de wereldpack. Vergruis het met een hamer.
Voeg het verbrijzelde filter toe aan de voorbereide 50 milliliter conische buis en verzegel de buis met parfum of labtape voor 10 minuten. Centrifugeer vervolgens de 50 milliliter buis gedurende één minuut bij 5.000 RPM. Verwijder bij kamertemperatuur zoveel mogelijk van de lysate en breng het over in een 15 milliliter buis voordat je opnieuw centrifugeert gedurende vijf minuten.
Bij 5.000 keer G wordt de supernatant vervolgens overgebracht naar een nieuwe 50 milliliter buis en wordt één volume van 100% ethanol toegevoegd aan de lysate. Trek met een 10 milliliter spuit de lysate op door een 18 tot 21 gauge naald en laat hem ongeveer vijf keer terugstromen. Gebruik voor de volgende extractiestappen de KaiGen R en easy mini kit volgens de instructies van de fabrikant, breng het lysate aan op de meegeleverde kolom met behulp van de vacuüm manifold of met herhaalde centrifugatie.
Kwantificeer de totale RNA spectrofotometrisch. Na het bepalen van de totale RNA-opbrengst, gebruiken we de Ambien turbo DNA free kit volgens de instructies van de fabrikant om eventuele DNA-contaminaties te verwijderen. Nu de RNA-extracties voltooid zijn, ga ik het totale RNA overdragen aan Johanna, die de eerste en tweede rRNA-verwijderingsstappen gaat uitvoeren.
Bedankt Rachel. Om de rRNA-verwijdering te beginnen, meng je voorzichtig en centrifugeer je kort de mRNA-only 10 keer reactiebuffer voor gebruik in een steriele RNA-vrije 0,5 milliliterbuis, combineer de juiste volumes van 10 keer reactiebuffer RNA-remmer, totale RNA-monster en terminator exonuclease. Volgens het epicenter-protocol, incubeer je de reactie gedurende 60 minuten bij 30 graden Celsius in een thermocycler met een verwarmd deksel of waterbad.
Beëindig vervolgens de reactie met een fenol-ethanol precipitatie Door eerst RNA-vrij water toe te voegen tot een totaal volume van 200 microliters en vervolgens één volume van een één-op-één fenol-chloroform-oplossing toe te voegen aan de mRNA centrifuge. Verzamel de waterige fase en precipitateer vervolgens met honderd procent ethanol en assalt. Dit is een potentieel stoppunt.
RNA kan worden bewaard bij minuus 80 graden Celsius totdat men klaar is om het monster te gebruiken in downstream toepassingen. Zodra we de eerste mRNA-verrijking hebben voltooid, zullen we de Ambien microbe enrich en microbe express kits volgens de instructies van de fabrikant gebruiken om eventuele resterende rRNA uit ons monster te verwijderen. Om de verwijdering van eukaryote rRNA te vergemakkelijken, zullen we de microbe enrich kit gebruiken.
Alle volumes worden bepaald door de instructies van de fabrikant te lezen. Om te beginnen, pipet 300 microliter bindingsbuffer in een 1,5 milliliter buis. Voeg vijf tot 100 microgram totaal RNA toe in een maximaal volume van 30 microliters en vortex.
Voeg voorzichtig twee microliters
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het genereren van cDNA uit omgevings-mRNA, met focus op mariene microbiële biomassa. Het proces omvat het verzamelen van totaal RNA, selectief verwijderen van rRNA, amplificeren van mRNA, en het synthetiseren van cDNA voor sequencing.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Omgevingsmicrobiologie
- mRNA analyse
- Bioinformatica
Achtergrond
- Mariene microbiële biomassa is cruciaal voor het begrijpen van omgevingsprocessen.
- cDNA synthese is essentieel voor het bestuderen van genexpressie.
- Selectieve amplificatie van mRNA verbetert de kwaliteit van sequencing data.
- Bioinformatica technieken worden gebruikt voor gen annotatie.
Doel van Studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor cDNA generatie uit omgevingsmonsters.
- Om het begrip van genexpressie in mariene microben te verbeteren.
- Om de sequencing en annotatie van geëxpresseerde genen te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Acquisitie van mariene microbiële biomassa door middel van filtratie.
- Extractie van totaal RNA uit achtergehouden organismen.
- Selectieve enzymatische degradatie om rRNA te verwijderen.
- Amplificatie van mRNA via polyA tailing en in vitro transcriptie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle synthese van cDNA uit verrijkte mRNA pool.
- Hoge kwaliteit sequences verkregen voor verdere analyse.
- Effectieve annotatie van geëxpresseerde genen met behulp van bioinformatica.
- Gedemonstreerde potentie voor het bestuderen van mariene microbiële gemeenschappen.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste aanpak voor cDNA synthese uit omgevings-mRNA.
- Verbetert het begrip van genexpressie in mariene ecosystemen.
- Biedt een waardevol hulpmiddel voor toekomstig onderzoek in omgevingsmicrobiologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Environmental transcriptomics enables unbiased profiling of gene expression in complex marine microbial communities, providing critical insight into ecosystem function and microbial dynamics. For biopharma R&D, these workflows support the discovery of novel genes, pathways, and potential bioactive targets from environmental sources. Integrating robust transcriptomic analysis at the early discovery stage enhances predictive confidence and informs portfolio decisions for natural product and microbiome-based innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of gene expression in native microbial consortia.
- Supports functional target validation by capturing active transcripts without prior gene knowledge.
- Facilitates biological de-risking by revealing real-time community responses to environmental stimuli.
- Improves predictive confidence for selecting candidate genes or pathways for downstream screening.
Screening & Assay Development
- Generates validated cDNA libraries for high-throughput screening of environmental gene products.
- Standardizes mRNA enrichment and amplification, ensuring reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable preparation of sequencing-ready material for platform-based discovery.
- Provides reliable input for functional assays targeting novel enzymes or metabolites.
Translational & Preclinical Research
- Aligns environmental gene expression data with translational biomarker discovery when relevant.
- Supports continuity from environmental sampling to preclinical validation of microbial-derived candidates.
- De-risks advancement by confirming activity and expression of targets in situ.
- Enables risk-adjusted decisions for progressing environmental leads into preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This transcriptomics workflow bridges environmental sampling and molecular analysis, positioning it at the interface of early discovery and lead identification for biopharma pipelines.
- Discovery Biology: Provides unbiased gene expression profiles to clarify pathways and validate functional targets in environmental samples.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cDNA libraries suitable for downstream screening and functional assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transcript abundance, supporting comparative analyses across conditions or time points.
- Translational Research: Offers continuity for advancing environmental gene candidates into preclinical evaluation when supported by expression data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for environmental transcriptomics applicable to diverse sample types and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection from environmental sources.
- Operational Value: Standardizes RNA extraction, rRNA removal, and amplification for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of environmental discovery programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel microbial-derived assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, enzymatic rRNA removal, and nucleic acid amplification.
- Demands access to filtration, extraction, and sequencing instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize RNA degradation and contamination.
- May require adaptation for different environmental matrices or microbial community compositions.
- Sample processing speed and RNA stability are critical practical limitations highlighted in the protocol.
