Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Deze procedure begint met het verkrijgen van mariene microbiële biomassa uit watermonsters door voorfiltratie via vijf en drie micrometer filters, gevolgd door opvang op een 0,22 micrometer filter. Totaal RNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit de organismen die op het 0,22 micrometer filter zijn achtergebleven. Ons RNA wordt verwijderd uit het totaal RNA door selectieve enzymatische degradatie en subtractieve hybridisatie; verrijkt Mr.N wordt lineair geamplificeerd via polyA-tailing en in vitro transcriptie.

Het geamplificeerde antisense RNA wordt vervolgens met behulp van random hexameren omgezet in dubbelstrengs cDNA. Het resulterende cDNA kan worden gekloond en gesequenced of direct pyrogesequenced. Hallo, ik ben Rachel Persky van het laboratorium van Dr. Marianne Moran aan de afdeling Marine Sciences van de University of Georgia.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het bestuderen van genexpressie uit milieu monsters, met gebruik van milieu-metatranscriptomics. Scott Gifford zal u laten zien hoe u milieu monsters verwerkt voor de collectie van RNA.

Ik zal laten zien hoe u RNA uit de monsters extraheert en de RINs van Johanna bepaalt. AON zal de RNA-verwijdering demonstreren. Maria Kosta zal vervolgens de stappen voor RNA-amplificatie en cDNA-synthese doorlopen.

Laten we beginnen. Om te starten met de collectie van milieu-RNA, stellen we het filterlijnsysteem in door één uiteinde van de slang in het water te plaatsen op de gewenste bemonsteringsdiepte en het tegenovergestelde uiteinde te bevestigen aan een filter van 3 µm met een hoge capaciteit, waarbij de pomp tussen de twee uiteinden van de slang wordt geplaatst. Het filter van 3 µm wordt vervolgens verbonden met de filtertoren van 0,22 µm en de uitstroom wordt van de toren van 0,22 µm naar een maatcilinder geleid.

Spoor verschillende liters water door het systeem om het te spoelen. Verwijder na voltooiing de slang uit het water terwijl de pomp draait om het resterende water uit de leiding te purgeren. Plaats vervolgens met een pincet een 0,22 micrometer filter op de filtertoren en sluit deze.

Plaats het uiteinde van de slang terug in het water en schakel de pomp in. Laat de lucht uit beide filters ontsnappen en monitor het gefilterde watervolume aan de hand van de carboy. Zodra het gewenste volume is gefilterd, verwijdert u de slang uit het water en laat u het resterende water uit het systeem lopen.

Zodra het filter droog is, verwijdert u snel de bovenste filterplaat en vouwt u het filterpapier. Plaats het filter in een whirl pack en vries het direct in met vloeibare stikstof. Voordat we aan het experiment beginnen, is het belangrijk om op te merken dat omdat RNA's overal voorkomen en mRNA's snel degraderen, de standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken in een ribonucleasede vrije omgeving moeten worden gevolgd, inclusief voor de werkoppervlakken en pipetten.

Met dit in gedachten dienen schone handschoenen te worden gedragen bij het hanteren van alle materialen die in deze procedure worden gebruikt. Bovendien moeten monsters zo kort mogelijk worden verwerkt. Om te beginnen met de totale RNA-extractie uit het 0,22 micrometer filter, bereiden we bead-beatingbuisjes voor door acht milliliter RLT-buffer met toegevoegde bèta-mercaptoethanol aan een conische buis van 50 milliliter toe te voegen.

Voeg vervolgens één tot twee milliliter RNA-beads uit een mobile power soil extraction kit toe. Haal het bevroren filter snel uit de vriezer terwijl het in de world pack blijft. Verbrijzel het met een hamer.

Voeg het verbrijzelde filter toe aan de voorbereide conische buis van 50 milliliter en sluit het buisdeksel af met parafilm of laboratoriumtape; vortex gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens de buis van 50 milliliter bij 5.000 RPM gedurende één minuut. Verwijder bij kamertemperatuur zoveel mogelijk van het lysaat en breng dit over naar een buis van 15 milliliter voordat er opnieuw vijf minuten gecentrifugeerd wordt.

Bij 5.000 ×g wordt de supernatant overgebracht naar een nieuwe buis van 50 milliliter en wordt één volume 100% ethanol aan het lysaat toegevoegd. Trek het lysaat met een spuit van 10 milliliter ongeveer vijf keer door een naald met een diameter van 18 tot 21 gauge. Voor de volgende extractiestappen wordt de KaiGen R and easy mini kit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant, waarbij het lysaat op de meegeleverde kolom wordt aangebracht met behulp van het vacuümsysteem of door middel van herhaalde centrifugatie.

Kwantificeer het totale RNA spectrofotometrisch. Na het bepalen van de totale RNA-opbrengst gebruiken we de Ambien turbo DNA free kit volgens de instructies van de fabrikant om eventuele DNA-contaminaties te verwijderen. Nu de RNA-extracties voltooid zijn, draag ik het totale RNA over aan Johanna, die de eerste en tweede stappen voor de rRNA-verwijdering zal uitvoeren.

Bedankt Rachel. Om te beginnen met de rRNA-verwijdering, mengt u de 10 keer reactiebuffer voor mRNA voorzichtig en centrifugeert u deze kort voor gebruik. Combineer in een steriele RNA-vrije buis van 0,5 milliliter de juiste volumes van de 10 keer reactiebuffer, RNA-inhibitor, totaal RNA-monster en terminator-exonuclease. Volgens het Epicentre-protocol wordt de reactie 60 minuten bij 30 °C geïncubeerd in een thermocycler met een verwarmde deksel of in een waterbad.

Beëindig vervolgens de reactie met een fenol-ethanolprecipitatie door eerst RNase-vrij water toe te voegen tot een totaal volume van 200 microliters en daarna één volume van een fenol-chloroformoplossing (1:1) toe te voegen aan het mRNA en te centrifugeren. Verzamel de waterige fase en precipiteer deze vervolgens met honderd procent ethanol en zout. Dit is een mogelijk stopmoment.

RNA kan worden bewaard bij -80 °C totdat het monster klaar is voor gebruik in downstream-applicaties. Nadat we de eerste mRNA-verrijking hebben voltooid, gebruiken we de Ambien microbe enrich- en microbe express-kits volgens de instructies van de fabrikant om eventueel resterend rRNA uit ons monster te verwijderen. Om de verwijdering van eukaryotisch rRNA te vergemakkelijken, gebruiken we de microbe enrich-kit.

Alle volumes worden bepaald aan de hand van de instructies van de fabrikant. Pipetteer ter start 300 µL bindingsbuffer in een buisje van 1,5 mL. Voeg 5 tot 100 µg totaal RNA toe in een maximaal volume van 30 µL en vortex.

Voeg voorzichtig twee µL capture oligo mix voor vijf µg RNA toe aan de bindingsbuffer en tik zachtjes tegen de buis. Centrifugeer het mengsel kort. Denatureer het mengsel 10 minuten bij 70 °C voordat het mengsel gedurende één uur bij 37 °C wordt geïncubeerd.

Bereid tijdens deze incubatie de oligo mag-beads voor door ze eenmaal te wassen in nucleasevrij water en eenmaal in bindingsbuffer, waarbij de beads tussen de wasbeurten op een magnetische standaard worden opgevangen. Bewaar de beads op ijs en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Verwarm de wasoplossing vijf minuten voor gebruik tot 37 °C in een warmteblok.

Voeg de RNA-capture oligo mix toe aan de gewassen oligo mag-beads, meng de buis voorzichtig en centrifugeer deze kort. Incubeer de mix kort gedurende 15 minuten bij 37 °C. Plaats de buis in het magnetische rek en wacht ongeveer drie minuten voordat het mRNA-bevattende supernatant wordt afgezogen en vervolgens overgebracht naar een opvangkolf op ijs.

Voeg vervolgens 100 µL voorverwarmde wasoplossing toe aan de opgevangen beads. Vortex de beads voorzichtig en verzamel het supernatant. Breng dit supernatant met mRNA over in de opvangbuis op ijs.

Plaats een opvangbuis op ijs terwijl u zich voorbereidt om prokaryotisch rRNA te verwijderen met de ambi microbe express kit, die we zullen gebruiken om residueel prokaryotisch rRNA te verwijderen. Gebruik een Bioanalyzer of Experion om te controleren op rRNA-contaminatie en mRNA-kwaliteit. Dit is een potentieel stoppunt.

RNA kan worden bewaard bij -80 °C. Zodra het rRNA is verwijderd, gebruiken we de Ambien message AMP two bacteria kit volgens de instructies van de fabrikant om ons mRNA te amplificeren. Nu we een zuiver mRNA-monster hebben, draag ik het experiment over aan Maria, die u door de mRNA-amplificatie en cDNA-synthese zal leiden.

Bedankt, Hannah. Voordat we beginnen met de mRNA-amplificatie, berekenen we de volumes van elke component van de mastermixen van de Ambien message AMP two bacteria kit online. We beginnen met de polyadenylering van het template RNA door maximaal 1000 nanogram totaal RNA in een steriele RNA-vrije microcentrifugebuis te plaatsen. Gebruik 6,5 microliters monster en geen RNA-vrij water in de eerste buffer om RNA te synthetiseren via in vitro transcriptie.

Het wordt aanbevolen om een hybridisatieoven of incubator te gebruiken vanwege de uniforme temperatuur. Omdat het uiterst belangrijk is dat er geen condensvorming in de buisjes optreedt, raden wij een incubatie van 14 uur voor de in vitro transcriptie-reactie sterk aan. Om de RNA-opbrengst te maximaliseren voor de hoogste A RNA-opbrengst, dient de IBT te worden uitgevoerd in een finaal reactievolume van 40 µL; bewaar A RNA bij -80 °C in aliquots van ongeveer 10 µL.

Zodra het RNA is geamplificeerd, is het tijd om het complementaire DNA of cDNA te synthetiseren. De Promega universal ribot Clone cDNA-synthesesysteemkit wordt gebruikt om cDNA uit het RNA te synthetiseren. De kit bevat instructies voor het omzetten van twee microgram RNA naar cDNA. Wij raden aan om zes tot 10 microgram RNA als input te gebruiken en de reacties dienovereenkomstig te schalen.

Reinig het cDNA met behulp van ethanolprecipitatie of het Promega Wizard DNA Cleanup-systeem. Bewaar de monsters volgens de instructies van de fabrikant bij -80 °C. Dubbelstrengs cDNA kan op dit punt direct worden gesequenced. Uit 10 liter zeewater hebben we ongeveer 10 µg milieu-RNA geëxtraheerd en 20 keer geamplificeerd. Door de omzetting van het geamplificeerde mRNA naar dubbelstrengs cDNA werden voldoende hoeveelheden materiaal gegenereerd voor sequencing en analyse van milieu-transcripten. We hebben zojuist aangetoond hoe genexpressie van mariene microbiële gemeenschappen kan worden beoordeeld met behulp van milieu-metatranscriptomica.

Houd er bij het uitvoeren van deze procedure altijd rekening mee dat mRNA snel afbreekt en dat RNA's overal aanwezig zijn. Neem daarom standaard voorzorgsmaatregelen om in een RNase-vrije omgeving te werken en verwerk de monsters zo snel mogelijk. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.