Name: Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Leer een methode voor cDNA-synthese uit milieu-mRNA van mariene microben met rRNA-verwijdering, mRNA-versterking en sequencing. Deze techniek verbetert de analyse van genexpressie in mariene ecosystemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering werd verstrekt door The Gordon en Betty Moore Foundation subsidies en de National Science Foundation te verlenen MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

Het onderzoek van genexpressie door natuurlijke microbiële gemeenschappen is gemeengoed geworden in de afgelopen jaren als een middel om de ecologische rollen en functies van micro-organismen te verkennen. Gebruikt in combinatie met de detectie, kwantificering en karakterisering van mariene micro-organismen, kunnen analyses van genexpressie worden gebruikt om de fylogenie koppelen aan de functie in natuurlijke microbiële gemeenschappen. Veel technieken voor het richten van de functionele expressie van genen zich op spec...

<table><tbody><tr><td>PowerSoil Bead Tubes</td><td>kit</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>mRNA-ONLY Prokaryotisch mRNA-isolatiekit</td><td>kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; Bacterieel mRNA-verrijkingskit</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt; kit</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II-Bacteriële RNA-amplificatiekit</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA-synthesesysteem</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA Clean-Up Systeem</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

het analyseren van genexpressie van marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analoog aan metagenomics, milieu transcriptomics (metatranscriptomics) haalt en sequenties milieu-mRNA&#39;s van een microbiële assemblage zonder voorafgaande kennis van wat genen van de gemeenschap zou kunnen uiten. Zo biedt de meest onpartijdige perspectief op gemeenschap genexpressie<em&gt; In situ</em&gt;. Milieu-transcriptomics protocollen zijn technisch moeilijk omdat prokaryotische mRNA&#39;s over het algemeen niet de poly (A) staarten dat isolatie maken van eukaryotische berichten relatief eenvoudig<sup&gt; 1</sup&gt; En vanwege de relatief korte half leven van mRNA&#39;s<sup&gt; 2</sup&gt;. Daarnaast mRNA&#39;s zijn veel minder overvloedig zijn dan rRNAs in totaal RNA extracten, waardoor een rRNA achtergrond vaak overweldigt mRNA signalen. Echter, technieken voor het overwinnen van een aantal van deze problemen recent ontwikkeld. Een procedure voor de analyse van de milieu transcriptomes door het creëren van kloon bibliotheken met behulp van willekeurige primers voor reverse-transcriptie en milieu-mRNA&#39;s te versterken is onlangs beschreven werd succesvol in twee verschillende natuurlijke omgevingen, maar de resultaten zijn vertekend door selectie van de willekeurige primers gebruikt om de cDNA synthese te starten<sup&gt; 3</sup&gt;. Advances in lineaire versterking van mRNA overbodig voor willekeurige primers in de amplificatiestap en maken het mogelijk om minder uitgangsmateriaal gebruiken het verminderen van de inzameling en verwerking de tijd van de monsters en daarmee het minimaliseren van RNA degradatie<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; In vitro</em&gt; Transcriptie methoden voor het versterken van mRNA te betrekken polyadenylating het mRNA en voorzien van een T7 promotor op het 3 einde van het transcript. Amplified RNA (ARNA) kunnen dan worden omgezet in cDNA verdubbelen met behulp van willekeurige hexameren en direct gesequenced door pyrosequencing<sup&gt; 5</sup&gt;. Een eerste gebruik van deze methode op het station ALOHA laten zien dat het nut voor het karakteriseren van microbiële gemeenschap genexpressie<sup&gt; 6</sup&gt;.

We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.

Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Analoog aan metagenomica haalt milieu-transcriptomica (metatranscriptomica) omgevings-mRNA's uit een microbiële assemblage en sequenseert deze...

Deze procedure begint met het verkrijgen van mariene microbiële biomassa uit watermonsters door voorfiltratie via vijf en drie micrometer filters, gevolgd door opvang op een 0,22 micrometer filter. Totaal RNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit de organismen die op het 0,22 micrometer filter zijn achtergebleven. Ons RNA wordt uit het totaal RNA verwijderd door selectieve enzymatische degradatie en subtractieve hybridisatie, waarna verrijkt Mr.N lineair wordt geamplificeerd via polyA-tailing en in vitro transcriptie.Het geamplificeerde antisense-RNA wordt vervolgens met behulp van random hexameren omgezet in dubbelstrengs cDNA. Het resulterende cDNA kan worden gekloond en gesequenced of direct pyro-gesequenced worden. Hallo, ik ben Rachel Persky van het laboratorium van Dr. Marianne Moran aan de afdeling Marine Sciences van de University of Georgia.Vandaag laten we u een procedure zien om genexpressie in milieumonsters te bestuderen middels omgevingsmetatranscriptomics. Scott Gifford zal u laten zien hoe u milieumonsters verwerkt voor de RNA-extractie.Ik zal laten zien hoe u RNA uit de monsters extraheert en de RIN-waarden bepaalt. AON zal de RNA-verwijdering demonstreren. Maria Kosta

analyzing-gene-expression-from-marine-microbial-communities-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.

Concentratie van de metabolieten van Low-density Planktonische Gemeenschappen voor het milieu Metabolomics met behulp van nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Hier presenteren we een uitgebreid protocol om de beschikbaarheid van organische en anorganische voedingsstoffen en de abundantie en structuur van microbiële en virale gemeenschappen in afgelegen mariene omgevingen te beoordelen.

Het ontrafelen van de Unseen Spelers in de Oceaan - A Field Guide to Water chemie en Mariene Microbiologie

Dit manuscript beschrijft het gebruik van de nieuwste technologie die wordt geleverd door DNA-microarrays. Microarrays geven een overzicht van de transcriptomische veranderingen in bacteriën die ontstaan onder specifieke omstandigheden. Bovendien benadrukken we hoe gemakkelijk grote hoeveelheden gegevens kunnen worden geanalyseerd door gebruik te maken van handige, in eigen beheer ontwikkelde softwarepakketten.

Een snelle en betrouwbare Pipeline voor Bacteriële Transcriptome Analyse Case study: Serine-afhankelijke genregulatie in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Er wordt een protocol gegeven om bacteriële 16S rRNA-genen en transcripten uit kustsedimenten te kwantificeren via real-time PCR. De methodologie omvat de gezamenlijke extractie van DNA en RNA; bereiding van DNA-vrij RNA; en kwantificering van 16S rRNA-genen en transcripten via RT-q-PCR, inclusief de constructie van een standaardcurve.

Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR

Hier presenteren we een protocol om de effecten van hydraulische breuken op nabijgelegen beken te onderzoeken door hun water- en sedimentmicrobiële gemeenschappen te analyseren.

Evaluatie van de impact van hydraulische breuk op stromen met behulp van microbiële moleculaire handtekeningen

Het protocol detecteert belangrijke methaancyclusgenen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas en visualiseert hun ruimtelijke verdeling om het begrip van methaanregulatie en de milieueffecten ervan in deze dynamische ecosystemen te vergroten.

Visualisatie van methaan-cyclische microbiële dynamiek in wetlands aan de kust

Leer een methode voor cDNA-synthese uit milieu-mRNA van mariene microben met rRNA-verwijdering, mRNA-versterking en sequencing. Deze techniek verbetert de analyse van genexpressie in mariene ecosystemen.

Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Meer video's verkennen