Name: Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer hoe je locomotie in volwassen Drosophila melanogaster kwantificeert met een hoogresolutie video-tracking systeem zonder verdoving. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van vliegbeweging mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant R01 GM54408 toegekend aan LC Griffith. We willen graag Fred Wolf bedanken voor al zijn hulp bij het ontwerpen van onze vierkante kamer en het opzetten van onze test, Frank Mello aan de Brandeis University machine winkel voor de bouw van onze kamer, en Dan Valente en Tim Lebestky voor nuttige gesprekken over analyse onderwerpen.

Deel 1: voeding en management van vliegen <ol><li> Vliegen moeten worden gekweekt in flesjes met gist-vrije standaard media. U moet een groot aantal vliegen, zodat kruisingen moeten worden opgezet. Vliegen moeten worden gekweekt in een 12-uur licht: donker cyclus bij 25 º C. </li><li> Vliegen worden verzameld kort na Eclosion (1-3 dagen). Vliegen kan worden gewerkt met op dit moment met behulp van een diffuser kooldioxide, en dient te worden gesorteerd in reageerbuizen met geautoclaveerd of gist-vrije media. Wij gebruiken alleen voor mannen, opgeslagen 10 in een reageerbuis. </li><li> Laat minstens een dag of twee na het gebruik van koolstofdioxide voor het uitvoeren van de gedragsexperimenten. We lopen vliegen in ons gedrag test 3-5 dagen na Eclosion. </li><li> Testen moeten altijd worden gedaan binnen dezelfde 2-3 uur tijd venster elke dag circadiaan ritme problemen te voorkomen. </li></ol> Deel 2: Het opzetten van de tracking-systeem in een gecontroleerde omgeving <ol><li> Alle experimenten worden uitgevoerd in een omgeving ruimte die een constante temperatuur van 25 º C met 70% vochtigheid behoudt. </li><li> Opschorten van een digitale video camera over het gebied dat moet worden opgenomen (camera naar beneden). Aangezien onze tracking software wordt het contrast-gebaseerd, we schorten de camera over een lichtbak. De camera registreert video&#39;s direct op een Dell-computer via een firewire aansluiting. We maken gebruik van een Sharp digitale videocamera, aangesloten op een Dell computer met Windows Moviemaker (Vista versie) voor video-acquisitie. </li><li> Lucht pulsen zal worden toegediend in dit protocol, dus een bron voor de luchtstroom moet aanwezig zijn in de kamer. Met behulp van rubberen slangen, sluit de lucht bron naar een koolstof filter voor luchtfiltering. </li><li> Het gebruik van meer rubber slang, sluit u de andere kant van de koolstof filter om een ​​erlenmeyer via een holle rubber stop, en vul de kolf met ongeveer een halve centimeter van het water. Dit zal bevochtigen de lucht. </li><li> De kolf moet ook een pistool, dat contact maakt met een Y-vormige klep via de rubber slang. </li><li> Een tak van de Y-klep moet worden aangesloten op een flowmeter. De andere tak moet leiden tot de lucht naar het plein voortbeweging kamer. </li></ol> Deel 3: Het leveren vliegt naar de voortbeweging kamer <ol><li> Het plein voortbeweging kamer is gebaseerd op het ontwerp van Wolf et al.. 2002 1, met de toevoeging van kleine druppel laden om de vliegen te voorkomen dat vliegen in de kamer. De kamer moet uit elkaar worden genomen, en alle componenten moeten grondig worden afgeveegd neer met 70% ethanol en gedroogd voor gebruik. </li><li> Anesthesie direct voor het uitvoeren van een gedrags-test kan mogelijk compromis prestaties. Om dit te voorkomen, zijn vliegen zachtjes klopte in de kamer met behulp van een trechter met een klein stopcontact. Om een ​​uitlaat van de juiste grootte, voeg een blauwe pipet tip (voor de P1000) aan het einde van een trechter. Gebruik een schaar af te snijden aan het einde van de pipetpunt om de opening groot genoeg voor een vlieg te passeren. </li><li> De top van onze kamer is een klein stukje van plexiglas is bevestigd met schroeven rond de randen. Als de schroeven worden verwijderd, kunnen de gaten worden gebruikt om vliegen te leveren in de kamer. Plaats de plexiglas boven, zodat het schroefgat zit direct boven de binnenste kamer in plaats van waar een schroef normaal zit. Neem een ​​reageerbuis met daarin de vliegen en plaats het ondersteboven over de trechter, die vervolgens moet worden geplaatst in het schroefgat. </li><li> Niet verplaatsen van de trechter, omdat dit zou kunnen kwetsen of schade aan het vliegen. In plaats daarvan voorzichtig klap de hele kamer, alle trechter en, totdat alle vliegen in de kamer. Dit kloppen moet worden gedaan op een muismat om de schok van deze bonzen op te vangen. Wanneer vliegt binnen zijn, verwijder dan de trechter, en opnieuw de positie van de plexiglas bovenkant over de schroef bedden. Dan re-schroef de plexiglas bovenkant op zijn plaats. </li></ol> Deel 4: Running het bewegingsapparaat Assay <ol><li> Zodra de vliegen correct is geladen, laat ze wennen in de kamer voor 30 minuten. Deze acclimatiseringsperiode dient plaats te vinden in de gecontroleerde omgeving (25 º C, 70% luchtvochtigheid), en de kamer moet worden geplaatst op de top van de lichtbak (die moeten worden ingeschakeld). Draai andere kamer lights off. </li><li> Na de acclimatiseringsperiode, schakelt u de Y-klep in de luchtstroom systeem zodanig dat de lucht alleen maar zullen terugvloeien naar de flowmeter. Zet de lucht en oprit van de lucht tot de gewenste snelheid (4,0-6,0 L / min). Wij gebruiken over het algemeen 5.0-5.5 L / min, maar elke snelheid in dit bereik zal werken. </li><li> Zodra de gewenste snelheid is bereikt, schakelt u de Y-klep, zodat de lucht stroomt naar de voortbeweging kamer. Keer dat deze lucht puls gedurende 15 seconden, en dan abrupt zet de lucht uit te schakelen. Als u de lucht uit, schakel de camera in de opnamestand. (Dit deel vergt oefening om alles te doen in een keer). </li><li> Stop de opname na de gewenste tijd en SAVE. We nemen 30 seconden proeven op 10 frames per seconde (minstens 8 trials per genotype). </li></ol> Deel 5: Analyse van de video&#39;s <ol><li> We gebruiken deDynamische Image Analysis System (DIAS)-software 3.2 voor motion tracking 2. Om deze software te gebruiken, moeten we eerst onze video&#39;s converteren naar een AVI-bestandsformaat met Quicktime 7.5.5. </li><li> Op te sporen de vliegen op basis van contrast, gebruiken we de &quot;autotrace door Threshold&quot;-functie. We dan gebruik maken van de &quot;Make pad van Trace&quot; functie voor het digitaliseren van deze sporen. </li><li> Om de output van de onmiddellijke snelheden van elk vliegen, gebruiken we de &#39;Compute Parameters &quot;functie om een ​​database-bestand te maken (DIAS-specifieke). Met behulp van deze functie, hebben we ook vlot de gegevens met behulp van een &quot;5,15,60,15,5&quot; Tukey Smoothing venster. </li><li> Zodra deze informatie is uitgestuurd als een database-bestand, kan het worden geopend in Microsoft Excel. We maken gebruik van een Matlab script op de momentane snelheden binnen Excel te compileren en extra parameters nodig zijn voor het begrijpen van rijdynamiek en bout de structuur te berekenen. </li></ol> Representatieve resultaten: Figuur 1 toont vertegenwoordiger sporen van wild-type Canton S organismen (figuur 1, links) en vliegt null voor de dCASK-gen, die werden gegenereerd door kruising van twee grote overlappende deleties (Df (3R) x307 en Df (3R) X313) (figuur 1 , rechter paneel). dCASK null vliegt eerder is aangetoond dat bewegingsapparaat problemen met Buridan&#39;s Paradigm 3 hebben, en in onze paradigma, in vergelijking met Canton S, laten zien dat ze sterk verminderd motoriek. We hebben altijd eerste run wild-type organismen om ervoor te zorgen dat de omstandigheden en het gedrag binnen de normale range op een bepaalde dag. We hebben waargenomen afwijkingen van de standaard reacties in minder dan 5% van de testdagen. Deze verschillen kunnen meestal worden toegeschreven aan problemen met de parameters van onze gecontroleerde omgeving. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_1.png" alt="" width="600" height="298" /> Figuur 1. DIAS-generated sporen van zowel wild type Canton S vliegt (boven, links) en Locomotorische-deficiënt dCASK Null vliegt gegenereerd op basis van overlappende verwijderingen (boven, rechts). De sporen geven wat er te zien in de opgenomen video&#39;s. Beide foto&#39;s contra sporen 8-10 vliegt gedurende 30 seconden in de video-tracking test na een lucht-puls. <img src="/files/ftp_upload/1096/figure_2.png" alt="" width="600" height="438" /> Figuur 2. Wild type vliegt werden uitgevoerd in het bewegingsapparaat assay (zie hierboven) na een lucht-puls (paars bars) en zonder een lucht-puls (blauw). In alle parameters berekend door de analyse-programma, waren er geen significante verschillen tussen de twee condities (bepaald met twee-tailed student t-test). Dit toont aan dat na een lucht-puls, vliegt normaal voortbewegen in onze setup.

<ol><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Analysis+of+Ethanol-Induced+Locomotor+Stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila.</a> J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).</li>
<li>Soll, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+computers+in+understanding+how+animal+cells+crawl%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cytology%22%5BJournal%5D)">The use of computers in understanding how animal cells crawl.</a> International review of cytology. 163, 43-104 (1995).</li>
<li>Martin, J. R., Ollo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Drosophila+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+%28Caki%29+is+localized+in+the+central+nervous+system+and+implicated+in+walking+speed%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed.</a> The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+Circadian+Clock+by+Social+Experience+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster.</a> Science. 298, 2010-2012 (2002).</li>
</ol>

In onze opstelling, een matig sterke lucht puls stopt tijdelijk vliegen beweging. Wanneer de lucht signaal eindigt, zijn de vliegen vrijgesteld van deze stationaire toestand en voortbewegen normaal, zoals weergegeven in figuur 2. Omdat deze lucht puls effectief synchroniseert motoriek van de bevolking, we gebruiken om het proces te beginnen, zodat we bestuderen ook het begin van beweging na een momentum-brekende stimulus. De test kan echter worden uitgevoerd zonder een lucht-puls, omdat het bewegingsapparaat parameters ...

<table><tbody><tr><td>Vierkante kamer</td><td>Instrument</td><td>Machinefabriek</td><td>N/A</td><td>Ontwerp van Wolf &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2002&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>Camera</td><td>Sharp</td><td>ViewcamZ VL-23</td><td></td></tr><tr><td>Debietmeter</td><td>Instrument</td><td>Cole-Parmer</td><td>SY-32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbak</td><td>Instrument</td><td>DNASTAR</td><td>Seq-Easy</td><td></td></tr><tr><td>Houtskoolfilter</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-744-37</td><td></td></tr><tr><td>DIAS 3.2</td><td>Software</td><td>Soll technologies</td><td>N/A</td><td>www.solltechnologies.com</td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie video-tracking van locomotion in adult drosophila melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Vliegen vormen een belangrijk model voor het bestuderen van complex gedrag te wijten aan de overvloed aan genetische tools beschikbaar voor onderzoekers op dit gebied. Studeren locomotorisch gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Vertrouwt op de mogelijkheid om te kunnen veranderingen in gang te kwantificeren tijdens of naar aanleiding van een bepaalde taak. Om deze reden, een hoge-resolutie video-tracking systeem, zoals degene die we beschrijven in dit artikel, is een waardevol instrument voor het meten van voortbeweging in real-time. Ons protocol omvat het gebruik van een eerste lucht-puls naar de vliegen momentum, gevolgd door een tweeëndertigste filmen periode in een vierkante kamer te breken. Een tracking programma wordt vervolgens gebruikt om de ogenblikkelijke snelheid van elke vlieg te berekenen in de kamer in 10 msec stappen. Analyse software verzamelt vervolgens deze gegevens, en de output een verscheidenheid van parameters zoals gemiddelde snelheid, max snelheid, tijd doorgebracht in beweging, versnelling, enz. Dit protocol zal de juiste voeding en management van vliegen te bespreken voor gedragsverandering taken, handling vliegen zonder verdoving of immobilisatie , het opzetten van een gecontroleerde omgeving, en het uitvoeren van de test van start tot finish.

De studie van complexe locomotorisch gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Is afhankelijk van de mogelijkheid om wijzigingen in de beweging een bepaalde vlieg&#39;s te kwantificeren. Dit artikel legt uit hoe u dit doen met behulp van een hoge-resolutie tracking systeem.

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Vliegen vormen een belangrijk model voor het bestuderen van complex gedrag vanwege de overvloed aan genetische instrumenten die beschikbaar zijn voor onderzoekers in dit vakgebied. Het bestuderen van ...

Bij de video tracking assay moeten de vliegen in een vierkante observatiekamer worden geplaatst zonder gebruik te maken van anesthesie. Hiervoor moet een kleine trechter worden uitgelijnd met de schroefgaten in de kamer, zodat de vliegen in de kamer kunnen worden gestuurd. Met behulp van deze trechter worden de gaten van de kamer vervolgens met schroeven afgedicht en wordt er via de luchtsleuven een luchtpuls toegediend om de locomotie te initiëren.Een videocamera die boven de kamer is opgehangen, legt deze voortbeweging vast en stuurt deze naar een computer waar de paden van de vliegen worden getraceerd en geanalyseerd. Hallo, ik ben Justin Slawson van het Griffith Lab hier bij de afdeling Biologie van Brandeis University. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor videotracking van voortbeweging met een hoge resolutie.We gaan deze procedure in ons laboratorium gebruiken om het locomotiegedrag bij volwassen vliegen te bestuderen. Laten we beginnen. Om met het experiment te starten, kweek vliegen in flessen met standaard medium zonder gist.Dit protocol vereist een groot aantal vliegen, dus de kruisingen moeten dienovereenkomstig worden opgezet. De vliegen moeten worden gekweek

high-resolution-video-tracking-locomotion-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft hoe je vrij lopende vliegen kunt volgen om hun algemene bewegingsvermogen te beoordelen. Het aanbevolen protocol demonstreert de installatie en gegevensanalyse van de test met behulp van videotrackingsoftware.

Vrij lopende vliegen volgen: een methode om voortbeweging in Drosophila te beoordelen

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier beschrijven we een eenvoudig en breed toegankelijk microscopie techniek om hoogwaardige digitale video van Drosophila volwassen en larvale mutante fenotype over te nemen van een zijdelingse perspectief.

Overname van hoge kwaliteit digitale video van Drosophila Larven en volwassen gedrag van een Lateral Perspectief

De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.

Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met behulp van de<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

We beschrijven gedetailleerde protocollen voor het gebruik van FLLIT, een volledig geautomatiseerde machine learning-methode voor het volgen van beenklauwen bij het vrij bewegende Drosophila melanogaster en andere insecten. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om kwantitatief te meten subtiele loopbewegingen in wilde type vliegen, mutant vliegen en vliegen modellen van neurodegeneratie.

Volledig geautomatiseerde leg tracking in vrij bewegende insecten met behulp van Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT)

Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudige volwassen Drosophila-gedragsobservatiekamer te maken en hoe high-definition foto's / video's van de morfologie of het gedrag van verschillende soorten fruitvliegen in de observatiekamer te maken door middel van relatief eenvoudige en betaalbare methoden.

Een aanpasbaar high-definition beeldvormingssysteem voor gedragsstudies van drosophila-volwassenen

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Gassen die onschadelijk lijken bij atmosferische druk kunnen gedrag zoals narcose veroorzaken onder hyperbare omstandigheden. Conventionele hyperbare drukkamers zijn kostbaar en arbeidsintensief. Deze studie presenteert een eenvoudige, goedkope methode om de effecten van xenon op Drosophila melanogaster bij matige drukken onder 4 atm te onderzoeken.

Validatie van het hyperbare druksysteem met Xenonanesthesie voor Drosophila melanogaster

Leer hoe je locomotie in volwassen Drosophila melanogaster kwantificeert met een hoogresolutie video-tracking systeem zonder verdoving. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van vliegbeweging mogelijk.

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen