Name: Sturen van hematopoietische cellen naar het beenmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Leer een protocol voor het bestuderen van hematopoëtische celhoming naar beenmergniches. Deze methode omvat isolatie, kleuring met kleurstof en het volgen van migratie in ontvangende dieren om transplantatie-efficiëntie te verbeteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit protocol werd getest en geoptimaliseerd in het laboratorium van Dr David Scadden. De financiering wordt verstrekt door het Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital Klinische hematologie en oncologie Fellowship Program.

<ol><li> We beginnen de homing experiment door extractie-cellen te worden gebruikt in het experiment. Voor deze huidige experiment zijn we geïnteresseerd in het vinden van wanneer de homing van hele beenmerg om de niches in de lange botten van de ontvanger dieren is verschillend voor beenmergcellen uit WT dieren, zoals C57BL/6J (WT) en die zijn transgene uitsparingen voor Lysophosphatidic Receptor 1 (LPAR1) (KO). </li><li> Voordat we beginnen met het experiment, zullen we verzamelen van de materialen die we nodig hebben voor dit experiment. In ons lab al de muis ontledingen worden uitgevoerd in een laminaire stroming weefselkweek kap vooral als de cellen zullen worden getransplanteerd naar een ontvanger in plaats van dier wordt gebruikt voor ex-vivo analyse. We beginnen met het plaatsen van een blauw laken in de kap. Andere benodigde objecten zijn een pincet en een scherpe schaar die zijn autoclaaf, een steriele disposable scalpel en alcoholdoekjes. We zullen aangepast PBS en een steriele 6 wells plaat, een vijzel nodig, stamper, 50cc blauw bedekt conische buis en een 70uM wegwerp filter. </li><li> We beginnen met het nemen van een WT en een KO muis. </li><li> Deze muizen zijn gedood door de CO 2 inademing en vervolgens ondergedompeld in 70% isopropranolol gedurende 5 seconden. Deze stap voorkomt vervuiling van de cellen van belang met de muis bont en in onze handen heeft niet geleid tot een compromis in de opbrengst van cellen of experimentele resultaten. </li><li> De muizen worden vervolgens ontleed op hun beurt met behulp van een tang en scherpe schaar. We beginnen meestal met de WT muis als een kwestie van routine. Een kleine snip is gemaakt in de ventrale huid van de muis bovenliggende de buik en de huid wordt dan opgerekt met behulp van de handen. De huid komt uit de achterste ledematen gemakkelijk. Het dijbeen en scheenbeen worden geëxtraheerd zorg niet aan de kop van het dijbeen te verdrijven, omdat dit bevat een grote hoeveelheid beenmerg. De bovenste ledematen zijn losgemaakt van de romp van het dier door gewoon toe te passen tractie aan hen, terwijl het houden van de romp bewegen. Dit verwijdert de bovenste ledematen als een stuk. De humeri worden vervolgens onttrokken aan de bovenste ledematen. </li><li> De verwijderde beenderen zijn geplaatst in gewijzigde PBS die is toegevoegd aan 6 well platen. Gewijzigd PBS wordt gemaakt door toevoeging van 2 ml van de warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 2 cc EDTA 0,5 M pH8. Deze oplossing wordt vervolgens gefilterd door een Nalgene 0,45 uM filter en kan worden opgeslagen bij 4 graden Celsius gedurende tenminste een maand. </li><li> Het is essentieel om de putten label in de plaat om correct te kunnen identificeren WT en KO botten. </li><li> De muis karkassen worden verwijderd en afgevoerd. </li><li> Een nieuw blad wordt geplaatst in de motorkap en de botten worden gereinigd met behulp van een disposable scalpel. </li><li> De gereinigde botten worden geplaatst een muis op een moment in de mortel. Twee ml gemodificeerde PBS wordt toegevoegd aan de mortel en de botten worden gebroken met behulp van een stamper. Het is belangrijk om eerste fragment van de botten met 10 heen en weer bewegingen van de stamper en ze vervolgens te verpulveren met een cirkelvormige draaiende bewegingen. Meestal doe ik 50 met de klok mee, dan 50 tegen de klok in beweging en zo verder tot het materiaal nog in de mortel is wit van kleur en de gewijzigde PBS toegevoegd aan het materiaal blijft wit of transparant. </li><li> Na elke set van 50 ronde verpletterende bewegingen, dragen we de vloeistof van de mortel tot een 70 uM filter geplaatst op de top van een 50 ml conische buis. Vergeet niet om 2 ml PBS toe te voegen aan de mortel na elke over te dragen aan het filter. U wilt niet om te proberen en verpulveren dorre beenderen of ze droog laten voor enige tijd, omdat dit zal leiden tot apoptose van cellen. </li><li> Zodra het materiaal in de vijzel wit wordt, wordt het materiaal in het filter naar de mortel en de verpletterende wordt opnieuw uitgevoerd. Dit zorgt ervoor dat de cellen in het filter niet worden verspild. Meestal duurt het een of twee sets van circulaire ronddraaiende bewegingen weer maken het materiaal in de mortel wit in kleur op welk moment de extractie van de cellen is voltooid. </li><li> De oplossing in de conische buis is nu gecentrifugeerd (vergeet dan niet om de cellen van de WT en KO muis gescheiden te houden. Vandaar dat u twee verschillende buizen (een met WT-cellen, de andere met KO cellen). Centrifugeer hebben bij 1200 rpm gedurende 10 minuten. </li><li> Aspireren uit de bovendrijvende gebruik van afzonderlijke aspirator pipetten voor elke buis. Voeg 2 cc van ACK lysis buffer aan elke pellet. Dit lysis buffer moet steriel zijn. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 8 cc van gemodificeerde PBS aan elke buis. Neem 10 ul van elk buisje en de pipet in twee afzonderlijke putten in een 96 wells plaat. Plaats de buizen in de centrifuge en spin ze op 1200 rpm gedurende 10 minuten. </li><li> Terwijl de buizen zijn spinning, voeg 30 ul van tryphan blauwe kleurstof en 60 ul van gemodificeerde PBS aan elk putje van de 96 wells plaat dat de cellen van belang draagt. </li><li> Voeg 10 ul van dit mengsel (gelieve goed te mengen door en neer te pipetteren) om een ​​hemocytometer en tellen van de cellen in de vier buitenste pleinen. </li><li> Het aantal cellen in elk monster per ml is het aantal cellen geteld dus gedeeld door 4 en multiplied door 100 000. </li><li> Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u de buizen uit de centrifuge en resuspendeer de cellen in PBS zonder calcium, magnesium of L glutamine bij een concentratie van 20 miljoen cellen per ml. Je zal ongeveer 5 ml van volume waarschijnlijk voor de WT en 5 ml van het volume voor de KO dier. Vanaf deze stap verder zullen we met behulp van PBS, niet gewijzigd PBS voor het protocol. </li><li> Aan elke buis toe te voegen Dii, een cel beitsen kleurstof, tot een uiteindelijke concentratie van 5UM te bereiken. Vortex onmiddellijk gedurende 10 seconden. Incubeer bij 37 graden gedurende 10 minuten en vermijd blootstelling aan licht. </li><li> Vul de buizen met PBS en spin gedurende 10 minuten bij 1200 rpm. </li><li> Na het centrifugeren, het supernatans aspireren en resuspendeer de cellen in PBS op 40 miljoen cellen per ml. </li><li> Belasting 500 ul in een cc spuiten met een 27G naald (5 spuiten voor de WT muis en 5 spuiten voor de KO muizen). Het kan verstandig om 6 spuiten voor te bereiden op elk cohort. Het hebben van een extra kan helpen als staartader injecties die we gaan doen kan lastig zijn. </li><li> Dek de spuiten met folie om de DII te houden van elkaar te vallen. </li><li> Injecteer 500 ul van de cel mengsel in elke ontvanger dier (5 voor elk cohort). </li><li> Deze dieren dienen te worden bestraald met 9 Gy bestraling van 4 tot 24 uur voorafgaand aan de injectie. </li><li> 48 uur na de injectie, oogst beenmerg van de achterste ledematen van elke ontvanger dier. </li><li> Werkwijze zoals hierboven beschreven voor de donoren. Resuspendeer de cellen van elk dier in een cc van PBS. Verkrijgen van een celgetal met behulp van een hemacytometer. </li><li> Lees op de LSR II flowcytometer van BD of een gelijkwaardig instrument. Het resultaat kan worden uitgedrukt als het percentage of absoluut aantal cellen in het beenmerg geanalyseerd die DII positief. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

Homing is het proces waarbij beenmergcellen waaronder stamcellen, progenitor cellen en gedifferentieerde cellen, hun weg naar het beenmerg na injectie in de bloedbaan of het beenmerg holte van muizen. Zoals blijkt uit de definitie, kan een wetenschapper ervoor gekozen om de homing van hematopoietische stamcellen, progenitorcellen of gedifferentieerde cellen geïdentificeerd door immunofenotypering en geïsoleerd door celsortering te bestuderen. Typisch wetenschappers injecteren beenmergcellen uitgeput voor lineage markers...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Steriel foetaal runderserum</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauwe oplossing</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysisbuffer</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropranolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD celmarkeringsoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI celmarkeringsoplossing</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

sturen van hematopoietische cellen naar het beenmerg

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is het fenomeen waarbij getransplanteerde hematopoietische cellen zijn in staat om te reizen naar en inenten of verblijf in het beenmerg vast te stellen. Verschillende chemomkines en receptoren betrokken zijn bij de homing van hematopoietische stamcellen. [1, 2] Dit document schetst de klassieke homing protocol dat wordt gebruikt in hematopoietische stamcellen studies. In het algemeen gaat het om het isoleren van de celpopulatie die homing dient te worden onderzocht, vlekken deze populatie met een kleurstof van belang en het injecteren van deze cellen in de bloedbaan van een ontvanger dier. De ontvanger dier wordt dan opgeofferd op een vooraf bepaalde tijd na de injectie en het beenmerg geëvalueerd voor het percentage of absolute aantal cellen die positief zijn voor de kleurstof van belang. In een van de meest voorkomende experimentele regelingen, het homing efficiëntie van hematopoietische cellen van twee genetisch verschillende dieren (een wild-type dier en de bijbehorende knock-out) wordt vergeleken. Dit artikel beschrijft de hematopoietische cellen homing-protocol in het kader van, zoals experiment.

Dit artikel beschrijft een protocol dat wordt gebruikt om de homing van hematopoietische cellen om hun niches studie in het beenmerg.

Sturen van hematopoietische cellen naar het beenmerg

Homing is het fenomeen waarbij getransplanteerde hematopoëtische cellen in staat zijn om naar het beenmerg te migreren en zich daar te nestelen of zich te vestigen. Diverse...

Homing is het verschijnsel waarbij getransplanteerde hematopoëtische cellen hun weg vinden naar het beenmerg van de ontvanger. Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van de homing van hematopoëtische cellen naar de respectievelijke gebieden in het beenmerg, door de gewenste celpopulatie te isoleren, deze populatie met een kleurstof te markeren en ze in de bloedbaan van een ontvangend dier te injecteren.Het percentage cellen dat positief is voor de kleurstof in het dier wordt vervolgens na een bepaalde tijd bepaald. Met deze methode kan de homing-efficiëntie van deze cellen van twee genetisch verschillende dieren worden vergeleken. Hallo, mijn naam is RHI Reen Yusef en ik ben postdoc-onderzoeker in het laboratorium van Dr. David Skadden bij het Center for Regenerative Medicine van het Massachusetts General Hospital en het Harvard Stem Cell Institute.Vandaag laten we u een procedure zien om het homing-proces van hematopoëtische stamcellen naar het beenmerg te bestuderen, waar ze normaal gesproken verblijven. We gebruiken dit protocol in ons laboratorium om de verschillen in homing van hematopoëtische stamcellen van verschillende genetisch gemodificeerde muizen te bes

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier beschrijven we een eenvoudig te implementeren, gestandaardiseerd, microfysiologisch systeem dat de complexiteit van de in vivo structuur van het menselijk beenmerg weerspiegelt en een relevant model biedt om een breed scala aan normale en pathologische gebeurtenissen nauwkeurig te bestuderen.

Een menselijk beenmerg 3D-model om de dynamiek en interacties tussen residente cellen in fysiologische of tumorale contexten te onderzoeken

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Leer een protocol voor het bestuderen van hematopoëtische celhoming naar beenmergniches. Deze methode omvat isolatie, kleuring met kleurstof en het volgen van migratie in ontvangende dieren om transplantatie-efficiëntie te verbeteren.

Sturen van hematopoietische cellen naar het beenmerg

Meer video's verkennen