Name: Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Leer micro-injectie van Xenopus laevis eicellen voor nucleocytoplasmatisch transportonderzoek met dunne sectie-elektronenmicroscopie. Deze methode biedt inzicht in celbiologische importmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) voor het verstrekken van de baculovirus AcMNPV en voor nuttige discussie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canada Foundation for Innovation (CFI), de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR), en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) .

Deel 1: Voorbereiding van Xenopus oöcyten voor micro-injectie <ol><li> Leg een klein stukje (ongeveer 2 cm) van de Xenopus laevis eierstok in een 50-ml conische buis met 20 ml collagenase-oplossing (5 mg / ml collagenase in de calcium-vrije gewijzigd Barth&#39;s zout: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Collagenase wordt gebruikt om de follikel cellen die de eicellen surround te verwijderen. </li><li> Plaats de buis op een shaker platform en schud het (op 100 RPM) gedurende een uur. Dit keer is afhankelijk van verschillende partijen collagenase. Dus na een uur, neem dan een kleine steekproef van eicellen en bestuderen ze onder een microscoop dissectie. Goed de-folliculated eicellen moet goed worden gescheiden van elkaar, en het moet gemakkelijk zijn om een ​​glazen naald in de eicel. Als de eicellen niet voldoende de-folliculated, worden ze achtergelaten in de collagenase oplossing en gecontroleerd weer om de vijf minuten. </li><li> Was de eicellen drie keer met een aangepaste Barth&#39;s zoutoplossing (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), en over te dragen naar een 100-mm diameter Petri schaaltje met MBS plus 1% penicilline / streptomycine. De eicellen zijn nu klaar om te worden gemicroinjecteerd. Als micro-injectie zal worden uitgevoerd op een andere dag, op te slaan de eicellen bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li><li> Behulp van een dissectiemicroscoop, selecteer rijpe stadium VI oöcyten voor microinjectie. Deze eicellen zijn groot, met een goed contrast tussen de zwarte dier halfrond en de crème-kleurige plantaardige halfrond. </li><li> Breng het volwassen stadium VI oöcyten in een microwell plaat (Nunc, 10 pi goed volume). Dit moet voorzichtig gebeuren, met behulp van een 200-ul pipet met een pipet tip die is afgesneden aan het einde ongestoord zuigkracht van de eicellen mogelijk te maken. </li></ol> Deel 2: micro-injectie van Xenopus oöcyten <ol><li> Bereid de import substraat te gemicroinjecteerd door het toevoegen van een kleine hoeveelheid van 1% broomfenolblauw, om te helpen bij het visualiseren van micro-injectie. Bijvoorbeeld, voegen we een pl broomfenolblauw tot 10 ul van de ondergrond. </li><li> Leg een smalle strook van Parafilm op een 100-mm diameter Petri schotel, en afzien van een 5-ul druppel van de oplossing te injecteren op de Parafilm strip. </li><li> Vul een eerder gekalibreerd injectienaald (verkregen door het trekken van een 6,6-il micropipet Drummond met de Inject + Matic Puller) met de oplossing te injecteren. Voor deze, is het microinjector ingesteld op aspiratie-modus. Te kalibreren de injectienaald te maken stip markeert op de naald om de 0,5 mm, wat overeenkomt met een volume van 50 nl. </li><li> Voor de cytoplasmatische injectie, steek de punt van de naald in een eicel in de plantaardige halfrond, zeer dicht bij het dier halfrond, op een ongeveer 45 graden. Draai de microinjector instelling microinject en microinject elke eicel met 50 nl van invoer substraat. De stip markeringen op de naald worden gebruikt om de hoeveelheid substraat die is geïnjecteerd te controleren. </li><li> Breng de geïnjecteerde eicellen om een ​​kleine (35-mm diameter) petrischaal gevuld met MBS, en incuberen bij kamertemperatuur voor de gewenste hoeveelheid tijd (tijdstippen zijn zo gekozen dat aan de waarneming van de import substraat geassocieerd met NPC&#39;s mogelijk te maken; dit gebeurt tussen 10 en 30 minuten voor eiwitten en voor virussen die actief worden vervoerd in de richting van de NPC, deze keer is ook afhankelijk van de plaats van injectie en de grootte van het eiwit / virus). </li><li> Als de incubatietijd is voltooid, transfer eicellen op een 4-ml glazen flacon met 2% glutaaraldehyde in MBS, en bevestig overnacht bij 4 ° C. </li></ol> Deel 3: Dissectie van Xenopus oöcyten <ol><li> De volgende dag, was de eicellen 3 keer met MBS. </li><li> Overdracht eicellen om een kleine petrischaal gevuld met een laag zout buffer (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,5). Met behulp van een dissectie microscoop en ontleden van een pincet, verwijder dan de vegetatieve pool van elke eicel. Het is nuttig om de eicel opengesneden met een pincet te stabiliseren, terwijl het andere paar wordt gebruikt als een schaar om de plantaardige paal te verwijderen. Op dit punt is het mogelijk om te beoordelen het succes van de micro-injectie door de aanwezigheid van een blauwe gloed in het cytosol. Het protocol wordt voortgezet alleen voor de eicellen die met succes waren gemicroinjecteerd. Bovendien, als de monsters worden voorbereid voor EM, deze dissectie stap maakt het veel gemakkelijker om de kern te vinden als knippen en snijden van de monsters. </li><li> Weer Bevestig de ontleedde eicellen met 2% glutaaraldehyde in LSB gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Na fixatie, wassen ontleed eicellen drie keer met LSB. </li></ol> Deel 4: Voorbereiding van Ingespoten Eicellen voor het inbedden en Thin-Sectioning EM <ol><li> Breng de ontleed eicellen om een ​​depressie glijden. Aspireren zoveel mogelijk van de vloeistof als poslijk, en dan snel (zodat ze niet uitdrogen) dekking van de ontlede eicellen met 2% een laag smeltpunt agarose. Terwijl de agarose is nog zacht, gebruik dan een pipet tip om de eicellen van elkaar te scheiden, en ervoor te zorgen dat elke eicel wordt naar boven of naar beneden (niet zijwaarts). </li><li> Laat de agarose te stollen voor ongeveer 10 minuten. Nadat de agarose stolt, gebruik dan een scheermesje om de agarose in kleine stukjes gesneden, elk met een ontleed eicel. </li><li> Plaats de agarose-embedded eicellen in een 4-ml glazen flacon en ze post-fix met 1% Oso 4 in LSB gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was het monster driemaal in LSB. Indien nodig, op te slaan van het monster bij 4 ° C gedurende de nacht en ga het protocol de volgende dag. </li><li> Opeenvolgend uitdrogen de monsters in een oplopende reeks van alcohol (50, 70, en 90% ethanol gedurende 20 min. elk). Dit wordt gevolgd door twee wijzigingen in 100% ethanol gedurende 15 min elk. Tenslotte uitdrogen monsters met 100% aceton gedurende 15 minuten. </li><li> Infiltreren monsters met een 1:1 mengsel van EPON (Fluka) en aceton gedurende een uur, gevolgd door infiltratie met een 2:1 mengsel van EPON en aceton gedurende twee uur, en uiteindelijk in pure Epon voor ten minste zes uur. </li><li> Leg monsters in flat inbedding mallen gevuld met verse pure Epon. De eicellen zijn gericht op een zodanige wijze dat de kant van de kern dichter bij de plaats van injectie - in dit geval de zijkant van de eicellen die is ontleed - wordt eerst coupes. Deze stap optimaliseert de kans op het visualiseren van invoer van het gekozen substraat. </li><li> Tot slot, polymeriseren de Epon gedurende twee dagen bij 60 ° C. </li><li> Om de monsters te visualiseren, worden de blokken gesneden en daarna in secties met behulp van een ultramicrotoom. Secties worden overgebracht op EM roosters, gekleurd met behulp van standaard procedure, en gevisualiseerd met een transmissie-elektronenmicroscoop. Wij zullen dit niet deel uitmaken van het protocol te zien zijn als het standaard EM procedure. </li></ol> Deel 5: representatieve resultaten: Als het protocol succesvol is geweest, dan is de nucleaire envelop (NE) en de NPC&#39;s moet duidelijk zichtbaar zijn in EM microfoto. Afhankelijk van de ondergrond geïnjecteerd en de hoeveelheid tijd tussen de injectie en fixatie, moet de ondergrond duidelijk zichtbaar zijn op de cytoplasmatische gezicht van de NPC, in het NPC, of ​​op de nucleaire gezicht van de NPC. Figuur 1 toont een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is geïnjecteerd met capsiden van het baculovirus AcMNPV, geïncubeerd bij 4 ° C gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne sectie EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Een capside docking op de cytoplasmatische gezicht van een NPC wordt aangegeven door een witte pijl. In tegenstelling tot Figuur 2 toont een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is ingespoten met het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne gedeelte EM zoals beschreven. Met behulp van deze techniek, hebben we ontdekt dat MVM verstoringen van de NE (Cohen en Pante, 2005) induceert. Tussen haakjes geven breuken in de NE. Pijlpunten wijzen op NPCs. Vermoedelijke MVM capsiden worden geassocieerd met het NE zijn aangegeven met witte pijlen. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figuur 1" width="600" height="459" /> Figuur 1: Electron microfoto van een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is geïnjecteerd met capsiden van het baculovirus Ac MNPV, geïncubeerd bij 4 ° C gedurende vier uur, en bewerkt voor inbedding en dun gedeelte EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Capsiden zijn aangegeven met witte pijlen. Schaal bar: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figuur 2" width="600" height="264" /> Figuur 2: Electron microfoto van een NE doorsnede met aangrenzende cytoplasma (c) en de kern (n) van een Xenopus eicel die is ingespoten met het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende vier uur, en verwerkt voor het inbedden en dunne gedeelte EM zoals beschreven. Pijlpunten wijzen op NPCs. Tussen haakjes geven breuken in de NE. Vermoedelijke MVM capsiden worden geassocieerd met het NE zijn aangegeven met witte pijlen. Schaal bar: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Micro-injectie van Xenopus oöcyten in combinatie met thin-coupes EM is een zeer effectief middel voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Dit systeem is gebruikt om verschillende stappen van de invoer kaart door middel van de NPC, bijvoorbeeld interactie van een nucleaire import substraat met structurele componenten van het NPC, zoals de cytoplasmatische filamenten en de nucleaire basket (beoordeeld door Pante, 2006). Het is ook gebruikt om de nucleaire import van nucleair-replicerende virussen (Pan...

micro-injectie van de xenopus laevis eicellen

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Micro-injectie van de Xenopus laevis oöcyten gevolgd door een dunne-snijden elektronenmicroscopie (EM) is een uitstekend systeem voor het bestuderen van nucleocytoplasmic transport. Door zijn grote kern en een hoge dichtheid van de nucleaire porie complexen (NPC), kan nucleair transport gemakkelijk gevisualiseerd in het Xenopus eicel. Veel inzicht in de mechanismen van de nucleaire import en export is opgedaan door het gebruik van dit systeem (beoordeeld door Pante, 2006). Daarnaast hebben we gebruik gemaakt van micro-injectie Xenopus oöcyten om de nucleaire import paden van verschillende virussen die zich vermenigvuldigen in de gastheer kern ontleden. Hier laten we zien de cytoplasmatische micro-injectie van Xenopus oöcyten met een nucleair import substraat. We tonen ook de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden EM, zoals dissectie, uitdroging, en inbedding van de eicellen in een epoxy hars inbedding. Tot slot bieden wij representatieve resultaten voor eicellen die zijn gemicroinjecteerd met het capside van het baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) of het parvovirus Minute Virus van Muizen (MVM), en bespreken mogelijke toepassingen van de techniek.

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen met een nucleair import substraat, alsmede de voorbereiding van de geïnjecteerde eicellen voor visualisatie door dunne-snijden elektronenmicroscopie.

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Micro-injectie in oocyten van Xenopus laevis, gevolgd door elektronenmicroscopie (EM) met dunne coupes, is een uitstekend systeem voor het bestuderen van nucleocytoplasmatische ...

Micro-injectie van Opus Lavu oocyten, gevolgd door elektronenmicroscopie van dunne coupes, is een uitstekend systeem voor het bestuderen van nucleocytoplasmatisch transport. In dit experiment worden de oocyten gedefoliëerd met collagenase, waarna oocyten in stadium zes worden geselecteerd en in een multi-well plaat worden geplaatst. De oocyten worden vervolgens gemicro-injecteerd met een nucleair importsubstraat, na incubatie van de oocyten bij kamertemperatuur om het substraat de kans te geven de nucleus binnen te treden.De cellen worden gefixeerd en gedissecteerd. De gedissecteerde cellen worden ingebed in laagsmeltende agarose, opnieuw gefixeerd met osmiumtetroxide, gedehydrateerd en ingebed in een epoxyhars. De in epoxy ingebedde monsters worden gesneden met een ultramicrotoom en de coupes worden geplaatst op een koperen EM-monsterrooster.Na het kleuren worden de coupes gevisualiseerd onder een transmissie-elektronenmicroscoop. Hoi, ik ben Sarah Cohen van het laboratorium van Dr. Nellie Pane van de afdeling Zoölogie aan de University of British Columbia. Ik ben Shelly Ow, ook van het Panta-lab.Vandaag tonen we u een procedure voor de micro-injectie van Xenopus laevis-cyten. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de nucleaire import van vrachten, zoals virussen, te bestuderen. Laten we beginnen.Om met het experiment te beginnen, plaatst u een klein stukje Zenap Lavis-eierstok van ongeveer twee centimeter in een conisch buisje van 50 milliliter met 20 milliliter collagenase-oplossing. Collagenase verwijdert de follikelcellen die de cytes omringen; plaats vervolgens het buisje op het schudplatform en schud voorzichtig bij 100 RPM gedurende 30 minuten. Deze tijd varieert afhankelijk van de verschillende lots collagenase.Neem na één uur een klein monster van de cytes en onderzoek deze onder een dissectiemicroscoop. Correct gedefolieerde cytes moeten goed van elkaar gescheiden zijn. Steek een glazen naald in een cyte om te controleren of deze gemakkelijk naar binnen glijdt.Indien de cytes onvoldoende gedefolieerd zijn, laat ze dan in de collagenase-oplossing en controleer dit elke vijf minuten opnieuw. Zodra de cytes voldoende gedereguleerd zijn, was ze drie keer met gemodificeerd bar-zoutoplossing en breng ze over naar een Petrischaal van 100 millimeter die MBS bevat plus 1% penicilline-streptomycine. Selecteer met behulp van een dissectiemicroscoop mature stadium zes cytes voor microinjectie.Deze lavere cellen zijn groot met een goed contrast tussen de zwarte dierlijke hemisfeer en de roomkleurige vegetatieve hemisfeer. Breng de volgroeide stadium zes cellen over naar een multi-well plaat. Gebruik hiervoor een 200 microliter pipetteur met een pipetpunt waarvan het uiteinde is afgeknipt om de oocyten ongehinderd op te zuigen en breng de oocyten vervolgens zorgvuldig over naar de multi-well plaat.We maken gebruik van een schaal zonder microwells met een well-volume van 10 µL. De EO-plaatsen zijn nu klaar voor micro-injectie. Bereid het te injecteren substraat voor door 1 µL 1% bromfenolblauw toe te voegen aan 10 µL substraat. De kleurstof bromfenolblauw maakt de micro-injectie visualiseerbaar.Plaats vervolgens een klein stripje parafilm op een Petrischaal van 100 millimeter diameter en breng een druppel van vijf µL van de injectieoplossing aan op het parafilmstripje. Neem daarna een injectienaald door een 6,6 µL Drummond micropipet te trekken met een inject plus Matt Puller. Kalibreer de injectienaald door om de 0,5 millimeter stippen op de naald aan te brengen, wat overeenkomt met een volume van 50 nL. Zet de micro-injector in de aspiratiemodus en vul de naald met de injectieoplossing voor cytoplasmatische injectie.Steek de naaldpunt in een cyte in de vegetatieve hemisfeer, zeer dicht bij de animale hemisfeer onder een hoek van ongeveer 45 graden. Zet vervolgens de instelling van de micro-injector op micro-injectie en injecteer elke cyte met 50 nanoliters importsubstraat. Houd de markeringen op de naald in de gaten om de hoeveelheid geïnjecteerd substraat te controleren zodra de injecties zijn voltooid.Breng de cellen over naar een Petri-schaal van 35 millimeter gevuld met MBS. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende de gewenste tijd. Kies tijdspunten die observatie mogelijk maken van het importsubstraat geassocieerd met nucleaire poriecomplexen of NPC's.We gebruiken doorgaans tijdspunten tussen 10 en 30 minuten voor proteïnen en virussen die actief naar het NPC worden getransporteerd. Deze tijdspunten zijn tevens afhankelijk van de injectieplaats en de grootte van het proteïne of virus. Wanneer de incubatie is voltooid, worden de cyten overgebracht naar een glazen flacon van 4 mL met 2% glutaraldehyde in MBS en overnacht gefixeerd bij 4 °C. Was de volgende dag de cyten drie keer met MBS; de cyten kunnen nu worden gedisseceerd.Breng de cellen over naar een kleine Petrischaal gevuld met een buffer met een lage zoutconcentratie. Verwijder met een dissectiemicroscoop en dissectiepincetten de vegetatieve pool van elke oocyten. Het is nuttig om de oocyt met één paar pincetten te stabiliseren terwijl het andere paar als schaar wordt gebruikt om de vegetatieve pool te verwijderen; deze dissectiestap maakt het veel gemakkelijker om de kern te vinden bij het trimmen en doorsnijden van de monsters voor elektronenmicroscopie.Op dit punt duidt de aanwezigheid van een blauwe tint in het cytosol op een succesvolle micro-injectie; verwijdere cellen die niet succesvol zijn geïnjecteerd. Fixeer vervolgens de gedissecteerde cellen opnieuw met 2% glutaraldehyde in LSB gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de gedissecteerde cellen na fixatie drie keer met LSB. Zodra de cellen zijn gewassen, kunnen de geïnjecteerde oocyten worden voorbereid voor inbedding en dunne doorsneden via elektronenmicroscopie (em).Breng de gedissecteerde oocyten over naar een concave objectglas, aspireer zoveel mogelijk van de vloeistof en handel vervolgens snel zodat ze niet uitdrogen. Bedek de gedissecteerde cytes met 2% low melting agarose terwijl de agarose nog zacht is. Gebruik een pipetpunt om de cytes van elkaar te scheiden en om ervoor te zorgen dat elke cyte ofwel met de voorkant naar boven of naar beneden ligt, maar niet zijwaarts.Laat het agros ongeveer 10 minuten uitharden. Zodra het agros is gestold, gebruik dan een scheermesje om het agros in kleine stukjes te snijden, waarbij elk stukje één gedissecteerde cyte bevat. Plaats de in agros ingebedde cytes vervolgens in een glazen buisje van vier milliliter en fixeer ze met behulp van een roterende mengmachine met 1% osmiumtetroxide in LSB gedurende één uur bij kamertemperatuur.Was na een uur fixeren het monster indien nodig drie keer in LSB. Bewaar het monster een nacht bij vier graden Celsius en vervolg het protocol de volgende dag. Dehydrateer de monsters opeenvolgend in 50%, 70% en 90% ethanol gedurende telkens 20 minuten en dehydrateer vervolgens twee keer in 100% ethanol gedurende telkens 15 minuten.Dehydrateer de monsters tenslotte gedurende 15 minuten met 100% aceton. Wanneer de dehydratiestappen zijn voltooid, infiltreer de monsters gedurende één uur met een mengsel van epon, flua en aceton in een verhouding van één-op-één, gevolgd door infiltratie gedurende twee uur met een mengsel van epon en aceton in een verhouding van twee-op-één, en tenslotte gedurende ten minste zes uur in puur epon. Wanneer de laatste infiltratiestap is voltooid, worden de monsters geplaatst in platte inbeddingsvormen gevuld met vers, puur epon.Oriënteer de cytes zodanig dat de zijde van de nucleus die zich dichter bij de injectieplaats bevindt, als eerste gesneden wordt. In dit geval zal de zijde van de cytes die is gedissecteerd, als eerste worden gesneden. Deze stap optimaliseert de kans om de import van het gekozen substraat te visualiseren.Zodra de cellen correct zijn georiënteerd, wordt het epon gedurende twee dagen bij 60 °C gepolymeriseerd. Na de polymerisatiestap worden met een ultramicrotoom coupes van 50 nm dik van de in epoxy ingebedde monsters gemaakt. Verzamel de coupes op een koperen EM-raster, kleur de monsters en visualiseer deze met een transmissie-elektronenmicroscoop.Als het protocol succesvol is verlopen, dan moeten de kernenvelope en NPC's duidelijk zichtbaar zijn in em-micrografieën. Afhankelijk van het geïnjecteerde substraat en de tijd tussen injectie en fixatie, moet het substraat zichtbaar zijn aan de cytoplasmatische zijde van de NPC in de NPC of aan de nucleaire zijde van de NPC. Dit representatieve resultaat toont een dwarsdoorsnede van een kernenvelope met aangrenzend cytoplasma en kern van een zenap-cyt cel die is geïnjecteerd met capsiden van het vao-virus.De pijlpunten A-C-M-N-P-V wijzen naar NPC's en een capsid dat aanlegt op de cytoplasmatische zijde van een NPC wordt aangegeven door een witte pijl. In tegenstelling hiermee toont deze figuur een dwarsdoorsnede van de kernenvelop met aangrenzend cytoplasma en nucleus van een zenap-oöcyt die is geïnjecteerd met het parvo virus van muizen. Met deze techniek hebben we ontdekt dat MVM verstoringen van de kernenvelop induceert.Haken geven breuken in de kernenvelope aan. Pijlpuntjes wijzen naar NPC's en vermoedelijke MVM-capsiden geassocieerd met de kernenvelope worden aangegeven door witte pijlen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u xap levu-cyten kunt micro-injecteren enly dissecteren.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat verschillende batches collagenase variëren. Test uw collagenase daarom zorgvuldig om de optimale tijd voor defoliatie te bepalen. Daarnaast kunnen de cytes na de defoliatie en de wasstap met MBS tot een week bij vier graden Celsius worden bewaard voorafgaand aan de micro-injectie.Houd ten slotte uw weefselblokjes altijd op ijs en laat ze nooit uitdrogen. Ze moeten volledig ondergedompeld blijven tijdens alle dehydratie- en infiltratiestappen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Leer micro-injectie van Xenopus laevis eicellen voor nucleocytoplasmatisch transportonderzoek met dunne sectie-elektronenmicroscopie. Deze methode biedt inzicht in celbiologische importmechanismen.

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Meer video's verkennen