Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo's.

Deze procedure begint met het bereiden van morpho en in vitro getranscribeerde cap mRNA. Een micropipet wordt gevuld door het morpho-bevattende oplossing te sifonen en het injectievolume wordt vervolgens gekalibreerd met behulp van een micrometer met een celfase. Zebravisembryo's worden vervolgens verzameld en gerangschikt in een microinjectiekamer voor micro-injecties in het dooier.

De werkoplossing wordt geïnjecteerd in het dooier net onder de cel en cytoplasmatische bewegingen worden gebruikt om de oplossing te dragen voor celmicro-injecties. Injecteer de oplossing in het celcytoplasma na injecties. Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius in E drie-medium en score voor fenotypes van belang in latere stadia.

Hallo, ik ben Shiloh Yuen van het laboratorium, de zoon van Dr. Sasha en het Departement Genetica aan de Yale University School of Medicine. Vandaag zullen we een robuuste micro-injectietechniek demonstreren voor het uitvoeren van mRNA-overexpressie en morpho-oligonucleotidegenkoppelingsstudies in zebravissen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de rol van de S-cilium in cystische nierziekten te bestuderen.

Dus laten we beginnen. Een krachtige aanpak voor genfunctiestudies is om in vitro getranscribeerde gekappe RNA in zebravisembryo's te micro-injecteren. In deze demonstratie zullen we een EGFP-gelabeld transcript micro-injecteren en gebruik maken van expressie van live volledige embryo GFP als een zichtbaar resultaat voor een succesvolle injectie.

Eerst zullen we een in vitro cap RNA transcriptiereactie uitvoeren op uw transcript van belang. In ons lab voegen we routinematig A-C-D-N-A van belang toe aan een PC's twee plus vector en voeren we een in vitro synthesereactie uit van grote hoeveelheden gekappe RNA met behulp van de M-bericht M-machine SP zes kit. Vervolgens zullen we de RNA-monster zuiveren door het door de RN easy mini kit te laten lopen of door fenol chloroform extractie en isopropanol precipitatie.

Bepaal zorgvuldig de concentratie van de RNA-voorbereiding en bewaar deze min 80 graden Celsius tot het klaar is voor gebruik op de dag van de injectie. Ontdooi het RNA-monster voorzichtig en draai het kortjes. Bereid nu een werkoplossing voor met steriel water en een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% fenolrood, fenolrood dient als een zichtbare marker voor de injectie van de oplossing in de embryo.

Hier zullen we een werkoplossing bereiden van 100 nanogram per microliter EGFP mRNA met 0,05% fenolrood. Ten slotte bewaar de werkstof op ijs en breng de RNA-voorraad terug naar min 80 graden Celsius. Ga door met de voorbereiding van de morpho wanneer u klaar bent om deze monster te injecteren.

Morino antisense oligonucleotiden worden veel gebruikt om genexpressie te wijzigen door translatie van een doelwitproteïne te blokkeren of door prem NA te wijzigen. Splicing morpho's in de zebravis dienen als een krachtig reverse genetica-instrument door genfunctie te koppelen. Hier zullen we een morpho-oligo micro-injecteren dat gericht is op de translationele initiatiesite van pkd twee. We gebruiken routinematig 300 M van een morpho-oligo, specifiek ontworpen voor een gen van belang verkregen van gene tools LLC.

We voegen vervolgens 100 microliter steriele water toe om een drie millimolair stockoplossing te maken en verdelen vervolgens de oplossing en bewaren deze bij min 20 graden Celsius tot het klaar is voor gebruik op de dag van de injectie. We verwarmen de morino-oplossing gedurende vijf minuten op 65 graden Celsius. Vervolgens koelen we de oplossing onmiddellijk af op ijs en draaien kort. Deze stap denatureert eventuele secundaire structuren in de oligo en zorgt ervoor dat de oplossing volledig gesolubiliseerd is.

Vervolgens zullen we een werkoplossing bereiden door de Morpho-oplossing te verdunnen in steriele water en een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% pinal rood. In deze demonstratie zullen we een werkoplossing van 0,5 millimolair PKD twee morino bereiden met 0,05% fenolrood. Houd de werkoplossing op kamertemperatuur en ga door met het vullen van de micropipet wanneer u klaar bent om deze monster te injecteren.

Om te beginnen, moeten we micropipetten fabriceren die voor de injecties worden gebruikt. Dit gebeurt door het verwarmen en trekken van BOS siliekaat glas capillaire buisjes in een micropipet polar apparaat. Zodra de naalden zijn getrokken, worden ze bewaard in een petrischaal boven een kleine hoeveelheid klei of kleefband.

Vervolgens bereiden we micro-injectiekamerplaten voor door 1,5% aros in een XE drie-medium platen te gieten met daarin wedge-vormige troggen. Dat zal dienen als een eenvoudige methode om de embryo's vast te houden tijdens de injectie. De agro-kamerplaten worden vervolgens aan de lucht blootgesteld en bewaard bij vier graden Celsius totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt.

Om de micropipet te beginnen vullen. Snijd het distale uiteinde af met een pincet of een chirurgisch scheermesje om een opening te maken die net zichtbaar is onder een dissectiemicroscoop bij 50 x vergroting. Plaats vervolgens twee microliters van uw werkoplossing.

Als een druppel op een dekglas, bevestig de achterkant van een micropipet aan een vijf milliliter spuit voorzien van slangen op een hypodermische naald en dompel lichtjes de distale punt van de micropipet in uw druppel werkoplossing. Zorg ervoor dat u de punt van de micropipet niet breekt. Sifon de werkoplossing door het distale uiteinde van de micropipet door de zuiger van de spuit te trekken.

Vervolgens zullen we het injectievolume van de micropipet kalibreren. Plaats een druppel minerale olie op een micrometer glijbaan en zet de stroom en luchttoevoer aan naar het drukpuls micro-injectieapparaat. Bevestig vervolgens de micropipet aan de micropipethouders van het micro-injectieapparaat.

De micro-injector is drukgeregeld en ontlading wordt geactiveerd door de voetpedaal onder de dissectiemicroscoop in te drukken. Test het injectievolume door de micro-injector te gebruiken om een druppel van uw werkoplossing op de micrometer olie te plaatsen. Meet de diameter van de druppel terwijl deze als een bol op de olie drijft.

Pas de duur en druk van injectie aan om uw injectievolume zorgvuldig te kalibreren. Deze stap helpt bij de