Name: Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryos. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Leer micro-injectie van mRNA en morfolino's in zebravis embryo's voor genexpressie- en knockdown-studies. Deze methode ondersteunt betrouwbaar onderzoek naar genfunctie in de ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH en PKD stichting ZS. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Yale Animal Resources Center (YARC) en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.

Deel 1: Voorbereiding van micropipetten, en micro-injectie kamer platen <ol><li> Fabriceren micropipetten door te verwarmen en te trekken borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Inc, 1B100-4) in een micropipet trekker apparaat (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97). Te slaan in een petrischaal op de top van kleine hoeveelheid klei of plakband. </li><li> Giet 1,5% agarose (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) in 1x E3 medium platen gevormd met wigvormige troughs dat zal als een eenvoudige methode dienen voor het houden van de embryo&#39;s tijdens de injectie (zoals beschreven in &#39;de zebravis Book &quot;) 1. Laat agar kamer platen stollen voor gebruik en bewaar bij 4 º C. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van RNA Een krachtige aanpak voor gen-functie studies is om microinject in-vitro getranscribeerde RNA afgedekt in de zebravis embryo&#39;s. Capped RNA gedraagt ​​zich op dezelfde wijze als eukaryote mRNA&#39;s gevonden in vivo door de aanwezigheid van het GLB analoog. Zebravis onderzoekers regelmatig gebruik maken van deze methode om overexpressie of misexpress hun gen van interesse. In deze demonstratie zullen we microinject een EGFP-gelabeld transcript en gebruik wordt gemaakt van hele embryo GFP-expressie als een zichtbare uitlezing voor een succesvolle injectie. <ol><li> Voer een in-vitro CAP RNA-transcriptie reactie op je cijferlijst van belang zijn. In ons lab hebben we regelmatig plaats een cDNA van belang in een pCS2 + vector en het uitvoeren van een in vitro synthese reactie van grote hoeveelheden van de afgetopte RNA met behulp van de mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc, AM1340). </li><li> Zuiveren de RNA-monster door het uitvoeren van het door de RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc, 74.104) of door fenol: chloroform extractie en isopropanol neerslag. </li><li> Zorgvuldig bepalen van de concentratie van het RNA-bereiding en bewaar bij -80 º C tot klaar voor gebruik. </li><li> Op de dag van de injectie, licht dooi de RNA-monster, vortex en kort spin down. </li><li> Bereid een werkende oplossing met steriel water en een uiteindelijke concentratie van 0,025 - 0.050% fenol rood (Sigma-Aldrich Co, P0290). Fenol rood fungeert als een zichtbare marker voor de injectie van de oplossing in het embryo. In dit artikel zullen we een werkende oplossing van 100 ng / ul EGFP mRNA voor te bereiden met 0,050% fenol rood. </li><li> Blijf werken monster op ijs en terug te keren RNA voorraad tot -80 ° C. </li><li> Ga verder met deel 4 zodra u gereed bent om dit voorbeeld te injecteren. </li></ol> Deel 3: Voorbereiding van morfolino Morfolino antisense oligonucleotiden worden op grote schaal gebruikt om de genexpressie te wijzigen door het blokkeren van de vertaling van een gerichte eiwit of door het wijzigen van pre-mRNA splicing 2,3. Morpholinos in de zebravis dienen als een krachtig reverse genetics instrument door iemand aan de functie van een gen. In dit artikel zullen we microinject een morfolino oligo gericht op de translatie-initiatie site van PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Op basis van eerder vastgestelde werken, verwachten we dat de geïnjecteerde embryo&#39;s na te bootsen fenotypisch PKD2 mutant vissen 4. <ol><li> We routinematig volgorde 300 nmol van een morfolino oligo speciaal is ontworpen voor een gen van interesse van Gene Tools, LLC (Philomath, OR). </li><li> Voeg 100 uL steriel water om een ​​3 mM voorraad-oplossing te maken. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C tot aan gebruik. </li><li> Op de dag van de injectie, warmte de morfolino-oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk Snap koel op ijs en spin kort. Deze stap denatureert secundaire structuren in de oligo en zorgt ervoor dat de oplossing volledig is opgelost. </li><li> Bereid een werkende oplossing door verdunning van de morfolino-oplossing in steriel water en een uiteindelijke concentratie van 0,025 - 0.050% fenol rood. In deze demonstratie zullen we de voorbereiding van een werkende oplossing van 0,50 mM PKD2 morfolino met 0,050% fenol rood. </li><li> Blijven werken oplossing bij kamertemperatuur. </li><li> Ga verder met deel 4 zodra u gereed bent om dit monster te injecteren .---- </li></ol> Deel 4: Het vullen van de micropipet met uw werkende oplossing <ol><li> Snijd de distale tip van een micropipet met een pincet of een chirurgische scheermes om een ​​opening die net zichtbaar onder een dissectiemicroscoop (Nikon Instruments, Inc, SM2645) bij 50x vergroting te creëren. </li><li> Plaats 2 uL van uw werkende oplossing als een druppel op een dekglaasje aan. </li><li> Bevestig de achterkant van een micropipet om een ​​5 ml injectiespuit voorzien van buizen op een injectienaald en lichtjes onder water de distale tip van de micropipet in je druppel werkende oplossing. Zorg ervoor dat het topje van de micropipet te breken. </li><li> Sifon de werkende oplossing door het distale uiteinde van de micropipet door aan de zuiger van de spuit. </li></ol> Deel 5: Het kalibreren van de micropipet injectievolume <ol><li> Plaats een druppel van minerale olie (Amerikaanse Bioanalytisch, Inc, AB00921-00025) op een micrometer (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> Schakel de stroom en luchttoevoer naar de druk-gepulste micro apparaat injector (World Precision Instruments Inc, PV830). </li><li> Bevestig de micropipet om de micropipet houder van de micro-injector apparaat. De micro-injector is druk geregeld en lozingen worden geactiveerd door het indrukken van het voetpedaal. </li><li> Onder de dissectie microscoop, test de injectie volume door gebruik te maken van de micro-injector tot een daling van uw werkende oplossing op de micrometer olie plaats. Meet de diameter van de druppel als het zweeft als een bol op de top van de olie. </li><li> Stel de duur en de druk van de injectie om zorgvuldig te kalibreren uw volume van de injectie. Deze stap helpt bij de reproduceerbaarheid van de micro-injectie experiment. In deze demonstratie worden alle micro-injecties worden gedaan met een druppel diameter van 0,15 mm (ongeveer 1,76 nL in volume). </li><li> Zodra uw injectie volume is gekalibreerd, gebruik dan de &quot;Hold&quot; knop op de micro-injector voor opvullen en het lekken van de micropipet te voorkomen. </li></ol> Deel 6: Het voorbereiden van bevruchte zebravis embryo&#39;s voor micro-injectie <ol><li> Zebravissen worden willekeurig paren in de eerste paar uur van iedere ochtend. Verzamel embryo&#39;s in het een-cellig stadium en plaats ze in 1x E3 medium. </li><li> Met behulp van een 3 ml overdracht pipet (Becton Dickinson Laboratoriumbestek, 357.524), regelen de embryo&#39;s langs de wig-vormige dalen in de micro-injectie kamer platen. </li><li> Verwijder het medium, zodat de embryo&#39;s ondiep onder water staan ​​en niet overstroomd. Deze stap helpt bij het oplossen van de embryo&#39;s naar de bodem van de troggen als in de penetratie van de chorion door de micropipet. </li></ol> Deel 7: micro-injectie door het chorion <ol><li> Manipuleren van de embryo&#39;s met de micropipet, zodat het cytoplasma van de een-cellig stadium embryo is zichtbaar onder de microscoop te ontleden. Zorg ervoor dat het topje van de micropipet te breken. </li><li> Dringen de chorion en dan de dooier met de micropipet om te injecteren in de embryo. In deze demonstratie zullen we de eersten zijn microinjecting in de dooier direct onder de cel, en laat cytoplasmatische stroming en diffusie naar de werking oplossing te brengen in de cel. Deze stroom is zichtbaar door de fenolrood toegevoegd aan de werkende oplossing. </li><li> Wij zullen directe injectie ook aantonen in de cel cytoplasma. Directe micro-injectie in de cel is meer robuust, maar tijdrovend als een goede embryo oriëntatie en micro-injectie techniek is vereist. Als het celmembraan is strenger dan de dooier membraan, is het vaak sneller om de micropipet binnenkomen via de dooier naar de cel cytoplasma te bereiken. Oriëntatie van de dier paal naar de bodem van de trog en het werken met vaste hand kan de steun in deze methode van de injectie. </li><li> Na de micro-injectie, plaatst u de embryo&#39;s in een petrischaal met de E3 medium en incubeer ze op 28,5 ° C voor een normale ontwikkeling. </li><li> In de komende uren en dagen van embryo-ontwikkeling, leven zij de embryo&#39;s voor uw fenotypen van belang. </li></ol> Deel 8: Representatieve resultaten EGFP mRNA overexpressie: Om te controleren voor het succes van de micro-injectie, zullen we toezicht houden op de expressie van GFP in de zich ontwikkelende embryo&#39;s vanaf schild stadium (~ 6 HPF) door in vivo hele embryo fluorescentie microscopie (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expressie van het construct is het meest sterk tijdens de vroege gebeurtenissen van de embryonale ontwikkeling en zal vaak dalen tijdens de ontwikkeling als de geïnjecteerde capped RNA wordt geleidelijk afgebroken en is afhankelijk van de stabiliteit van de expressie gebrachte eiwit. PKD2 translationele-blokkerende morfolino: Op basis van eerder gepubliceerde resultaten, verwachten wij dat het PKD2 morphants aan de dorsale lichaam as kromming zoals gevonden in PKD2 mutant zebravis en aanwezig nieren cysten op ongeveer 2 na te bootsen - 3 DPF 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Representatieve resultaten van micro-injectie van EGFP mRNA-en PKD2 augustus morfolino. (A) TAB-embryo&#39;s werden gemicroinjecteerd op de een-cellig stadium met 0,17 ng van EGFP mRNA en gevisualiseerd op een DPF voor in vivo GFP expressie. (B, c) TAB embryo&#39;s werden gemicroinjecteerd op de een-cellig stadium met ~ 1,7 nl van een PKD2 translationeel blokkeren morfolino bij 0,50 mm en scoorde voor het dorsale lichaam kromming op 4 DPF.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Micro-injectie in de zebravis embryo&#39;s is een gevestigde en robuuste techniek voor het verkennen van de rol van een bepaald gen in ontwikkeling. Toepassingen zijn onder andere overexpressie, misexpression en knockdown testen van uw gen van belang evenals epistatisch analyse tussen meerdere genen. Micro-injectie in de zebravis is op grote schaal gebruikt voor het genereren van transgene dieren, en in kaart brengen lot van de cel in het begin van blastula embryo&#39;s 5,6,7,8,9. Daarnaast is de toepassing v...

Alle andere materialen worden vermeld in het protocol.

micro-injectie van mrna en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Een essentieel instrument voor het onderzoek naar de rol van een gen tijdens de ontwikkeling is de mogelijkheid om gen knockdown, overexpressie en misexpression studies uit te voeren. In zebravis (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Micro-injectie van RNA, DNA, eiwitten, antisense oligonucleotiden en andere kleine moleculen in de zich ontwikkelende embryo biedt onderzoekers een snelle en robuuste test voor het verkennen van genfunctie<em&gt; In vivo</em&gt;. In deze video-artikel zullen we zien hoe voor te bereiden en microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Gesynthetiseerd EGFP mRNA en een translatie-blokkerende morfolino oligo tegen<em&gt; PKD2</em&gt;, Een gen geassocieerd met autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD), in een-cellig stadium zebravis embryo&#39;s. Wij zullen Vervolgens analyseren van het succes van het mRNA en morfolino-micro-injecties door te controleren of GFP expressie en fenotype-analyse. Brede toepassingen van deze techniek zijn onder het genereren van transgene dieren en kiem-lijn hersenschimmen, cel-lot in kaart brengen en gen-screening. Hierin beschrijven we een protocol voor overexpressie van EGFP en de knock-down van<em&gt; PKD2</em&gt; Door mRNA en morfolino oligonucleotide injectie.

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo&#39;s. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Een essentieel hulpmiddel voor het onderzoeken van de rol van een gen tijdens de ontwikkeling is de mogelijkheid om gene knockdown, overexpressie en misexpressie uit te voeren ...

Deze procedure begint met het voorbereiden van morpholino en in vitro getranscribeerd cap-mRNA. Een micropipet wordt gevuld door de morpholino-bevattende oplossing op te zuigen, waarna het injectievolume wordt gekalibreerd met behulp van een micrometer-enkelcelpodium. Daarna worden zebravissembryo's verzameld en geplaatst in een micro-injectiekamer voor micro-injecties in de dooier.De werkende oplossing wordt in het dooiergedeelte net onder de cel geïnjecteerd en cytoplasmatische bewegingen worden gebruikt om de oplossing naar de cel voor micro-injecties te transporteren. Injecteer de oplossing in het cytoplasma van de cel na de injecties. Incubeer de embryo's bij 28,5 °C in E3-medium en beoordeel de relevante fenotypes in de daaropvolgende stadia.Hoi, ik ben Shiloh Yuen van het laboratorium van Dr. Sasha en de afdeling Genetica van de Yale University School of Medicine. Vandaag demonstreren we een robuuste microinjectietechniek voor het uitvoeren van mRNA-overexpressie en morpholino-oligonucleotide gene knockdown-studies in zebravis. We maken in ons laboratorium gebruik van deze procedure om de rol van het ciliaire apparaat bij cysteuze nierziekten te bestuderen.Laten we beginnen. Een krachtige methode voor het bestuderen van genfuncties is het micro-injecteren van in vitro getranscribeerd, gecapt RNA in zebravisembryo's. In deze demonstratie zullen we een EGFP-gelabeld transcript micro-injecteren en de GFP-expressie in het levende hele embryo gebruiken als zichtbare indicator voor een succesvolle injectie.Eerst voeren we een in vitro transcriptie-reactie van gecapte RNA uit op het transcript van belang. In ons laboratorium voegen we routinematig het gewenste cDNA in een pCS2+ vector in en voeren we een in vitro synthese-reactie uit van grote hoeveelheden gecapt RNA met behulp van de mMessage mMachine SP6-kit. Vervolgens zuiveren we de RNA-monsters door deze te verwerken met de RNeasy Mini Kit of via fenol-chloroformextractie en isopropanolprecipitatie.Bepaal zorgvuldig de concentratie van de RNA-preparatie en bewaar deze bij -80 °C tot het moment van gebruik op de dag van de injectie. Ontdooi de RNA-monsters, vortex deze lichtjes en centrifugeer ze kort. Bereid nu een werkoplossing met steriel water en een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% fenolrood; fenolrood dient als zichtbare marker voor de injectie van de oplossing in het embryo.Hier bereiden we een werkoplossing van 100 nanogram per microliter EGFP mRNA met 0,05% fenolrood. Bewaar tot slot de werkmonsters op ijs en plaats de RNA-voorraad terug bij minus 80 graden Celsius. Ga over tot de voorbereiding van de morpho wanneer u klaar bent om dit monster te injecteren.Morino antisense-oligonucleotiden worden op grote schaal gebruikt om genexpressie te modificeren door de translatie van een doeleiwit te blokkeren of door pre-mRNA-splicing te modificeren. Morpholino's in de zebravis dienen als een krachtig instrument voor reverse genetica door genfuncties uit te schakelen. Hier zullen we een morph-oligo micro-injecteren die gericht is op de translationele initiatieplaats van pkd2. Wij gebruiken routinematig 300 M van een morph-oligo, specifiek ontworpen voor een gen van belang, verkregen van Gene Tools LLC.We voegen vervolgens 100 µL steriel water toe om een 3 mM voorraadoplossing te maken, waarna we de oplossing in aliquoten verdelen en bewaren bij -20 °C tot het moment van gebruik op de dag van de injectie. We verwarmen de morino-oplossing vijf minuten lang bij 65 °C. Daarna koelen we de oplossing onmiddellijk snel af op ijs en centrifugeren we deze kort; deze stap denatureert eventuele secundaire structuren in het oligo en zorgt ervoor dat de oplossing volledig is opgelost.Vervolgens bereiden we een werkopleossing door de Morpho-oplossing te verdunnen in steriel water tot een eindconcentratie van 0,025 tot 0,05% fenolrood. In deze demonstratie bereiden we een werkopleossing van 0,5 millimolair PKD two morino met 0,05% fenolrood. Bewaar de werkopleossing bij kamertemperatuur en ga over tot het vullen van de micropipet wanneer u klaar bent om deze sample te injecteren.Om te beginnen moeten we micropipetten maken voor de injecties. Dit gebeurt door BOS-silicaatglaskapillairen te verhitten en uit te trekken in een micropipetten-trekapparaat. Zodra de naalden zijn getrokken, worden ze bewaard in een petrischaal op een kleine hoeveelheid klei of plakband.Vervolgens bereiden we microinjectiekamerplaten door 1,5% agarose in drie XE-mediumplaten te gieten die zijn gevormd met wigvormige geulen. Dit dient als een eenvoudige methode om de embryo's vast te houden tijdens de injectie. De agarosekamerplaten worden vervolgensstrakgelaten en bewaard bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor gebruik.Om de micropipet te beginnen te vullen, snijdt u de distale tip af met een pincet of een chirurgisch scheermesje om een opening te creëren die net zichtbaar is onder een dissectiemicroscoop bij een vergroting van 50 x. Plaats vervolgens twee µL van uw werkoplosser.Plaats een druppel op een dekglas en bevestig de achterkant van een micropipet aan een spuit van vijf milliliter, voorzien van slang en een hypodermische naald. Dompel de distale tip van de micropipet lichtjes onder in de druppel werkoplossing. Let erop dat de tip van de micropipet niet breekt. Sifon de werkoplossing via het distale uiteinde van de micropipet door aan de zuiger van de spuit te trekken.Vervolgens kalibreren we het injectievolume van de micropipet. Plaats een druppel minerale olie op een micrometerdiafragma en schakel de stroom- en luchttoevoer van het drukpuls-microinjectieapparaat in. Bevestig daarna de micropipet aan de micropipethouder van het microinjectieapparaat.De micro-injector is drukgecontroleerd en de afgiften worden geactiveerd door op het voetpedaal onder de dissectiemicroscoop te drukken. Test het injectievolume door met de micro-injector een druppel van uw werkopleossing op de micrometerolie te plaatsen. Meet de diameter van de druppel terwijl deze als een bol bovenop de olie drijft.Pas de duur en de druk van de injectie aan om het injectievolume zorgvuldig te kalibreren. Deze stap draagt bij aan de reproduceerbaarheid van het micro-injectieexperiment. In deze demonstratie worden alle micro-injecties uitgevoerd met een druppeldiameter van 0,15 millimeter.Ten slotte, zodra het injectievolume is gekalibreerd, gebruikt u de hold-knop op de micro-injector om terugvullen en lekken van de micropipet te voorkomen. Nu is het tijd om de zebravisembryo's voor te bereiden. Zebravissen paren willekeurig; verzamel in de eerste paar uur van elke ochtend om met de voorbereiding te beginnen embryo's in het eencellige stadium en plaats deze in one XE three medium.Plaats de embryo's met een transferpipet van drie milliliter in de wigvormige geulen van de micro-injectieplaten. Verwijder het medium zodat de embryo's ondiep ondergedompeld zijn en niet overstroomd raken. Deze stap helpt om de embryo's naar de bodem van de geulen te laten zakken en vergemakkelijkt de penetratie van het chorion door de micropipet.Nu beginnen we met de injecties. Eerst manipuleren we de embryo's met de micropipet zodat het cytoplasma van het embryo in het eencellige stadium zichtbaar is onder de dissectiemicroscoop. Let erop dat u de punt van de micropipet niet breekt; penetreer het chorion en vervolgens de dooier met de micropipet om in het embryo te injecteren.In deze demonstratie zullen we eerst micro-injecteren in de dooier direct onder de cel en de cytoplasmatische diffusie gebruiken om de werkopleossing in de cel te brengen. Deze stroom is zichtbaar dankzij het fenolrood dat aan de werkopleossing is toegevoegd. Aangezien dit een embryo uit één enkele cel is, kan de injectie handmatig of met een manipulator worden uitgevoerd.We zullen ook directe injectie in het cytoplasma van de cel demonstreren. Directe micro-injectie in de cel is robuuster, maar tijdrovender omdat een correcte oriëntatie van het embryo en een specifieke micro-injectietechniek vereist zijn. Omdat het celmembraan rigider is dan het dooimembraan, is het vaak sneller om met de micropipet via het eigeel de cel te bereiken.Het positioneren van het cytoplasma zodanig dat de dierpool naar de bodem van het gootje is gericht en het werken met een vaste hand kunnen helpen bij deze injectiemethode. Plaats de embryo's na microinjectie in een Petrischaal met E three-medium en incubeer ze bij 28,5 °C voor een normale ontwikkeling. Observeer de embryo's gedurende de volgende uren en dagen van de embryo-ontwikkeling op de fenotypes waarin u geïnteresseerd bent.Om het succes van de micro-injectie te verifiëren, zullen we de expressie van GFP in de ontwikkelende embryo's monitoren vanaf het schildstadium via in vivo fluorescentiemicroscopie van het gehele embryo; de expressie van het construct is het sterkst tijdens de vroege gebeurtenissen van de embryonale ontwikkeling en zal vaak afnemen tijdens de ontwikkeling, naarmate het geïnjecteerde gecapte RNA geleidelijk wordt afgebroken, afhankelijk van de stabiliteit van het tot expressie gebrachte eiwit. Op basis van eerder gepubliceerde resultaten verwachten we dat het PKD2-morfino de kromming van de dorsale lichaamsas nabootst, zoals gevonden in PKD2-mutante zebravisjes, en niervormige cysten vertoont op ongeveer twee tot drie dagen na bevruchting.We hebben u zojuist een robuuste micro-injectietechniek getoond voor het uitvoeren van mRNA-overexpressie en morpholino-oligonucleotide gene knockdown-studies in zebravis. Onthoud bij het uitvoeren van deze procedure dat het belangrijk is om met een vaste hand te injecteren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo's in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Het protocol beschrijft gerichte knockdown van genexpressie bij zebravissen door morfolino-injectie in de staart.

Morpholino-injectie: een methode om doelgenexpressie neer te halen om functie bij zebravissen te bestuderen

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

In deze video, Nijole Jasinskiene toont de methoden die gebruikt worden om transgene Aedes aegypti muggen, die vectoren voor knokkelkoorts te genereren. De technieken voor het correct opstellen van micro-injectie naalden, droogmiddelen embryo's en het uitvoeren van micro-injectie worden aangetoond.

Micro-injectie van A. aegypti embryo&#39;s om transgene muggen verkrijgen

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Leer micro-injectie van mRNA en morfolino's in zebravis embryo's voor genexpressie- en knockdown-studies. Deze methode ondersteunt betrouwbaar onderzoek naar genfunctie in de ontwikkelingsbiologie.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo's.

Meer video's verkennen