Micro-injectie van de zebravis embryo's Gene functie analyseren

Mannelijke en vrouwelijke zebravisjes worden gepaard in een kweekkooi waarin bevruchte eitjes naar de bodem zakken, waar ze gemakkelijk kunnen worden opgevangen. De eitjes worden vervolgens in een Petrischaal tegen een microscopische glaasje in een rij geplaatst. Daarna wordt de gevulde injectienaald afgeknipt en worden de injectie-instellingen aangepast, zodat de injectiebolus de gewenste grootte heeft wanneer deze met een micrometer wordt gemeten.

Ten slotte worden de eieren één voor één in de rij geïnjecteerd. Hallo, ik ben Jonathan Rosen van het laboratorium van John MA in de afdeling Cardiologie van het Children's Hospital Boston. En ik ben Michael Sweeney, ook werkzaam in het VY-lab.

Vandaag gaan we demonstreren hoe mRNA of morpholino kan worden geïnjecteerd in zebravissenembryo's. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om de effecten van knockdown of overexpressie van specifieke genproducten te bestuderen. Laten we beginnen.

Om te beginnen moeten de vissen- en kweekbakken de avond vóór de injectie worden ingericht met scheidingswanden om de totale eiproductie te verhogen. Indien gewenst kunnen de vissen worden geplaatst in een verhouding van twee vrouwtjes op één mannetje. De volgende ochtend, nadat de kamerverlichting is ingeschakeld, worden de scheidingswanden uit meerdere bakken verwijderd om ongeveer 20 minuten ongestoorde paringstijd toe te staan. Verzamel de eieren uit de kweekkooien met een zeef en spoel ze met eierwater voordat ze in een Petrischaal worden gegoten.

Met gebruik van eierwater kunnen vissen worden hergegroepeerd in grotere tanks om extra rondes eieren voor injectie te produceren. Pas de timing van de eierverzameling aan zodat het maximale aantal eieren wordt geproduceerd zonder dat ze het eencellige stadium passeren. Plaats ten slotte een microscoopglaasje in het omgekeerde deksel van een 100 millimeter Petri-schaal.

Gebruik een transferpipet om de eitjes tegen de zijkant van het preparaatglas te lijnen zodat er een enkele kolom wordt gevormd, en verwijder vervolgens het overtollige eiwater van het preparaatglas door een Kimwipe tegen de zijde tegenover de eitjes te drukken. Daarna bereiden we de micro-injectienaalden voor met behulp van een micropipet-puller. We trekken een glazen capillair met een buitendiameter van 1 millimeter uit tot twee naalden en bewaren deze naalden in een Petrischaal van 150 millimeter. Door ze over hellingen van siliconenkit te leggen, kunnen de naalden vooraf worden getrokken.

We gebruiken de volgende instellingen. Heat 6 45 pole 60 velocity 80. Vul het brede uiteinde van de naald met drie µL injectiemateriaal met behulp van een microloader-pipet.

Schud de bolus richting de naaldpunt totdat er nog maar weinig of geen luchtbellen overblijven. Vervolgens schakelen we de luchtbron en de micro-injector in. Plaats de naald in de micro-injector en zorg voor een luchtdichte afsluiting in de behuizing.

Controleer of de micromanipulator in een juiste positie staat om een breed bereik aan beweging en aanpassing mogelijk te maken. Breng de naaldpunt in het gezichtsveld van de microscoop. Houd deze hoog boven het objecttafeltje en focus op het dunste gedeelte van de punt.

Gebruik een scherp pincet om de naald af te knippen op een punt waardoor de naalden smal genoeg blijven om door het chorion en de dooier te dringen, maar nog steeds in staat zijn om een consistente kraalformaat te leveren. Om het volume van elke injectie te berekenen, gebruiken we een druppel minerale olie op een micrometer; voer de naald in de olie in en druk op het voetpedaal om een kraal van de oplossing in de olie te injecteren. Controleer de grootte van de kraal terwijl de naald wordt bijgesneden en pas de injectiedruk aan indien nodig tijdens het injecteren in de olie.

Een kraal met een diameter van 0,1 millimeter bevat 500 picoliter injectiemateriaal. Er worden doorgaans injectievolumes van 500 picoliter of één nanoliter gebruikt. Ideale injectievolumes vullen ongeveer 10% van het ei-volume.

De kwaliteit van de naaldpunt is cruciaal voor zowel het gemak van de injectie als de kwaliteit en consistentie van de resultaten. Het is nu tijd om te injecteren en de injectieprocedure te starten. Zorg ervoor dat de embryo's niet verder zijn ontwikkeld dan het viercellige stadium.

Idealiter moet het embryo zich in het eencellige stadium bevinden. Laat vervolgens de naald richting de kolom eieren zakken, doorboor het oppervlak van het chorion en dring in één vloeiende beweging het eigeel binnen terwijl u dit observeert. Bij eventueel verbrijzelen of scheuren van de dooierzak dient het injectiemateriaal in het eigeel te worden geïnjecteerd.

Voorkom het injecteren van luchtbellen en let tijdens het proces op embryo's die zichtbaar beschadigd zijn door de injectie. Pas indien nodig de druk aan om een consistente drupelgrootte te behouden en verwijder met een pipetpunt eieren die onbevrucht lijken of die tijdens het injectieproces zijn beschadigd. Verplaats na het voltooien van een kolom eieren de geïnjecteerde eieren met een zachte stroom eierwater naar een schone Petrischaal en herhaal dit indien nodig.

Houd enkele niet-geïnjecteerde embryo's aan als controle. Verwijder later op de eerste dag de dode embryo's en noteer het aantal geïnjecteerde embryo's. Vervang periodiek het eiwater in de schaal om de kans op infectie te verkleinen.

Houd er rekening mee dat embryo's, afhankelijk van wat er wordt geïnjecteerd, met een lager percentage kunnen overleven dan hun niet-geïnjecteerde broedjes en zusjes. Gelukkig is het eenvoudig om grote aantallen embryo's te injecteren, waardoor dit zelden een probleem is. We tonen nu enkele representatieve resultaten van zowel morpho-injectie als mRNA.

De niet-geïnjecteerde controle op 48 uur na bevruchting ziet er naar verwachting normaal uit. Embryo's die zijn geïnjecteerd met de morpho HG E drie i drie eeg FFR één, die HG-isovormen uitschakelt die de eerste van twee EEG-achtige herhalingen bevatten, vertonen echter oedeem in de hersenen en injectieschade aan het hart. Injectie van hart-glas Mr.NA produceerde ook een duidelijk fenotype op 24 uur na bevruchting.

De koppen van de niet-geïnjecteerde controles zagen er normaal uit. Omgekeerd vertoonden sommige van de embryo's die waren geïnjecteerd met M NNA opia. We hebben zojuist aangetoond hoe de injectie van morpholino's of mRNA tijdens het eencellig stadium de expressie van specifieke genen tijdens de latere ontwikkeling kan verhogen of verlagen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om dit ook te onthouden.

Een hoge concentratie van zowel mRNA als morpholino kan leiden tot aspecifieke letaliteit in de embryo's met het morpholino. Elk type moet empirisch worden getest, maar doorgaans zorgen concentraties tussen 200 en 500 micromolair voor een specifieke knockdown van de genactiviteit zonder dat dit leidt tot algehele letaliteit. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.