Name: Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer de geautomatiseerde isolatie van menselijke eilandjes van Langerhans voor transplantatiebiologie. Deze methode toont spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel met collageenaseperfusie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door de financiering van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie ​​(RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.

1. Facility setup <ol><li> Human eilandje isolatie is een tijd gevoelig procedure die teamwork meebrengt, en dus vier personen nodig zijn om deze procedure te voeren. Het team wordt geleid door de chirurg, die ontleedt en cannulates de alvleesklier. </li><li> Het eilandje isolatie begint de minuut van het team komt in de UIC eilandje isolatie faciliteit. De teamleden zorgen dat alle nodige instrumenten, zoals de centrifuge, wordt gecontroleerd en is ingeschakeld. Ze zorgen er ook voor alle kappen en oppervlakken te ontsmetten. </li><li> Twee mensen zullen het opzetten van de cannulatie tafel, slush machine, de spijsvertering circuit, perfusie-eenheid, COBE zuivering machine, en chirurgische tabellen. </li><li> Tegelijkertijd zullen twee andere teamleden de voorbereiding van de media die nodig zijn tijdens isolatie. </li><li> Vervolgens worden bacteriologie buizen (flessen, buizen, vorm en tas), monstername buizen (pre-gevuld met wassen), en beoordeling buizen en platen voorbereid. </li><li> De voorbereiding van de zuivering buis als volgt: De 1e tube leeg en gemarkeerd op 150 ml, buizen 2-12 gevuld met 200 ml van de M199 media aangevuld met humaan albumine (wassen oplossing) en gemarkeerd op 230 ml, en tenslotte een 50 ml conische buis gevuld met 50 ml wasoplossing. Eens deze voorbereidende stappen zijn voltooid zijn we klaar om te beginnen met het voorbereiden en perfuseren de alvleesklier. </li></ol> 2. Pancreas voorbereiding en perfusie <ol><li> Om te beginnen de voorbereiding en perfusie van de alvleesklier, een operateur verwijdert het orgel van de verpakking met behulp van steriele techniek. De chirurg zal overdracht van de alvleesklier naar de sanering tafel. </li><li> De chirurg vult een 60 ml spuit met de originele alvleesklier behoud oplossing en geef het aan een exploitant, die zal gebruiken om voorbereid &quot;Procurement&quot; bacteriologie flessen te vullen. </li><li> Na een visuele inspectie om te bepalen of het orgaan geschikt is voor eilandje isolatie (Als de alvleesklier is beschadigd Tijdens de verkrijging of anatomisch abnormaal is, kan het niet worden gebruikt voor eilandje isolatie), zal de chirurg te vragen een operator om collagenase te bereiden. Vergeet niet dat dat het opnieuw schorsing varieert tussen verschillende enzym merken en kavels. </li><li> Als de chirurg klaar is, brengen de sanering oplossingen (Betadine, fungizone / Cefazolin en HBSS) om de sanering tafel en giet ze in de daarvoor bestemde containers. Chirurg voert pancreas decontaminatie wassen voor een minuut de alvleesklier in elk van de decontaminatie-oplossing. De alvleesklier wordt dan geplaatst in een klein steriel potje waarin het zal worden gewogen. Nadat het gewicht is ingevoerd in de batch-record, wordt de alvleesklier geplaatst in de cannulatie pan met wat behoud oplossing. </li><li> De chirurg zal blootstellen en gedeeltelijk incise de belangrijkste kanaal en canule elke helft van de alvleesklier met een canule. De canule wordt gewaarborgd door hechtdraad. Om perfuseren de alvleesklier, eerste stap naar de perfusie-eenheid en giet het enzym oplossing in het bekken. Totale perfusie is ongeveer 10 minuten, bij 80 mmHg gedurende 5 minuten, daarna op 180 mmHg gedurende 5 minuten. Pancreas opgezwollen na perfusie. </li><li> Verplaats de perfusie alvleesklier naar de cannulatie pan, waar het vetweefsel wordt getrimd voorzichtig uit de alvleesklier. Knip dan de alvleesklier in 10-12 stukken en over te dragen aan Ricordi Kamer voor de spijsvertering. </li></ol> 3. Pancreas spijsvertering <ol><li> Om te beginnen de spijsvertering stap, de overdracht van de alvleesklier naar de lege kamer Ricordi, voeg een 2,5 ml flacon van Pulmozyme, zet op het scherm (vermijd grote brok van weefsel blok de kamer), sluit de kamer, en vullen van het systeem. </li><li> Start het overpompen van de oplossing gedurende 5 minuten. Schud de kamer gelijkmatig te verspreiden in heel warme oplossing. Na vijf minuten, schud de kamer voor de gehele spijsvertering fase. Handhaaf de temperatuur op 37 ˚ C. </li><li> Schud de kamer totdat de temperatuur bereikt 37 °, dan schud de kamer. Neem een ​​monster om de twee minuten detecteren of gratis eilandjes zijn te vinden onder het toepassingsgebied. Noteer het eilandje evaluatie-informatie bij de vertering tabel van de partij vast te leggen. Blijf het percentage van de eilandjes te controleren tot er 50% van hen zweven vrij en geïsoleerd in de oplossing. </li></ol> 4. Tissue collectie <ol><li> Zodra 50% van de eilandjes zijn te vinden vrij in de monsters, wordt de spijsvertering gestopt door toevoeging van koude RPMI verdunningsoplossing in het circuit. Weefsel wordt verzameld in 500 ml conische buizen voorgevuld met 30 ml humaan albumine. Nadat de buizen zijn gesponnen, zuig uit de bovendrijvende en was het pellet met koud wassen oplossing. Spin de conische buizen op 1100 RPM (rotaties per minuut) gedurende 1 minuut, 4 ˚ C. </li><li> Combineer de hele verzameling buizen opgehangen met verteerde pancreas weefsel in een 500 ml konische. Wanneer een buis vol met gewassen weefsel, spin en herhaal het wasproces tot alle weefsel is gewassen meerdere keren. Spin deze buis en breng het weefsel in een 250 ml conische buis. Breng het volume tot 250 ml metM199 wasoplossing aangevuld met HA en voor te bereiden voor de bemonstering. </li><li> Neem een ​​1 ml monster met een pipet en toe te voegen aan een 15 ml conische buizen pre-gevuld met 9 ml wasoplossing. Meng vervolgens door voorzichtig omkeren van de 15 ml conische buis en uit deze, monster uit 1 ml direct in een rooster tellen schotel. Tellen van de cellen, en bereken het aantal cellen met behulp van een verdunningsfactor van 2500 (10x250). </li><li> Spin de 250 ml conische buis en voeg 150 ml van UW (Universiteit van Wisconsin) oplossing die meestal gebruikt voor orgel bewaring. Wanneer UW wordt toegevoegd, meng grondig de celsuspensie met behulp van de pipet. Opnemen en aan de zuivering operator de starttijd in UW. Laat de tube (s) op ijs en swirl af en toe. Nu de eilandjes kan verder worden gezuiverd. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Er zijn verschillende factoren die van invloed de isolatie uitkomst 9,10. Onder hen, de spijsvertering van de pancreas weefsel speelt een prominente rol. Op basis van onze eigen menselijke eilandje isolatie ervaren, hebben we samengevat volgende kritische punten, die mogelijk invloed hebben op de eilandje opbrengst en kwaliteit. <ol><li> De spijsvertering is anders wanneer verschillende soorten enzymen worden gebruikt. </li><li> Zodra 40-50% van de eilandjes volledig gescheiden van acinaire weefsel, moet de spijsver...

<table><tbody><tr><td>Ijs-slushmachine</td><td>apparatuur</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>steriel ijs maken</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>apparatuur</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td><td>apparatuur</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekschaal met 2 mm raster</td><td>apparatuur</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>islet-telling</td></tr><tr><td>Digitaal waterbad EX7</td><td>apparatuur</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>apparatuur</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc Balance AB 104-S</td><td>apparatuur</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>pancreasgewicht meten</td></tr><tr><td>MasterFlex II snelheidsregelaar</td><td>apparatuur</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>stroomsnelheid tijdens digestie aanpassen</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>apparatuur</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Perfusie-eenheid</td><td>apparatuur</td><td>Custom Made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Koeler voor perfusie-eenheid</td><td>apparatuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Ricordi-kamer</td><td>apparatuur</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-verdunningsoplossing</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconcin (UW) oplossing</td><td>reagens</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25% Human Albumin</td><td>reagens</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium (wasoplossing)</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB1 GMP-graad</td><td>reagens</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale Protease NB1 GMP-graad</td><td>reagens</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>reagens</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>reagens</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Dithizon</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

human eilandjes van langerhans isolatie: deel i: spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes<sup&gt; 1</sup&gt;, Zonder het risico van ernstige hypoglycemische episodes die geassocieerd worden met intensieve insulinetherapie. Zorgen voor voldoende eilandje massa is van belang voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. Echter, donor karakteristieke, orgaanverkrijging en het behoud van invloed op de uitkomst isolatie<sup&gt; 2</sup&gt;. Aan de Universiteit van Illinois in Chicago (UIC) hebben we een succesvolle isolatie protocol met een verbeterde zuivering gradiënt<sup&gt; 3</sup&gt;. Het programma startte in januari 2004, en meer dan 300 isolaties werden uitgevoerd tot en met november 2008. De pancreata werden in koude behoud oplossingen (UW, Universiteit van Wisconsin-of HTK, Histidine-tryptofaan Ketoglutaraat)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Om de Cell Isolatie Laboratory van UIC voor eilandje isolatie. Pancreaseilandjes werden geïsoleerd met behulp van de UIC-methode, die is een gewijzigde versie van de methode die oorspronkelijk beschreven door Ricordi<em&gt; Et al.</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. In het kort, na het reinigen van de pancreas van het omringende weefsel, werd het geperfuseerd met enzym-oplossing (Serva Collagenase + Neutraal protease of Sigma V enzym). De opgezwollen alvleesklier werd vervolgens overgebracht naar de Ricordi spijsvertering kamer, aangesloten op een aangepaste, gesloten circulatie buizen systeem, en opgewarmd tot 37 ° C. Tijdens de spijsvertering, was de kamer zachtjes geschud. Monsters werden continu genomen om de spijsvertering voortgang te bewaken. Eenmaal vrij eilandjes werden ontdekt onder de microscoop, de spijsvertering werd gestopt door spoelen koud (4 ° C) RPMI verdunningsoplossing (Mediatech, Herndon, VA) in de circulatie systeem om het enzym te verdunnen. Na te zijn verzameld en gewassen in M199 media aangevuld met humaan albumine, was het weefsel bemonsterd voor pre-zuivering tellen en geïncubeerd met UW oplossing voor de zuivering. Zuiveringsproces zullen worden beschreven in deel II: Zuivering en cultuur van de mens eilandjes.

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het beheer van type 1-diabetes is belastend, zowel voor het individu als voor de samenleving, met jaarlijkse kosten van meer dan 100 miljard dollar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van ...

Deze procedure begint met het verkrijgen van normaal donorpancreasweefsel. Na een korte trimstap wordt de uitgezette pancreas in gelijke stukken gesneden en verplaatst naar de digestiekamer. De pancreas wordt gecannuleerd en een collagenase-oplossing wordt via de canule geïnfuseerd door een automatische perfusiemachine.Ten slotte wordt het pancreatische weefsel verzameld in conische buizen met een groot volume en vervolgens verder gezuiverd voor eilandje-transplantatie, wat in een volgende video zal worden getoond. Hallo, ik ben American Chief van het Lab of Human Eyelet Program van de afdeling Chirurgie aan de University of Illinois in Chicago. Hallo, mijn naam is Barbara Barbero en ik maak ook deel uit van het Human Eyelet Program.Vandaag tonen we u een procedure voor de isolatie van menselijke pancreaseilandjes. We gebruiken deze procedure in onze faciliteit om menselijke eilandjes van hoge kwaliteit te oogsten voor klinisch gebruik. Laten we beginnen.De isolatie van menselijke eilandjes is een tijdgevoelige procedure die teamwork vereist en daarom vier personen nodig heeft om deze procedure uit te voeren. Het team wordt geleid door de chirurg die de pancreas disseceert en canneleert. De isolatie van de eilandjes begint op het moment dat het team de UIC-faciliteit voor eilandjesisolatie betreedt.Teamleden zorgen ervoor dat alle benodigde instrumentatie, zoals de centrifuge, is gecontroleerd en is ingeschakeld. Ze zorgen er ook voor dat alle zuttkappen en oppervlakken worden gedesinfecteerd. Twee personen stellen de canulatietafel, de slush-machine voor digestie, de circuitperfusie, de unit cope zuiveringsmachine en de operatietafels klaar.Tegelijkertijd bereiden twee andere teamleden de media voor die nodig zijn tijdens de isolatie. Vervolgens worden bacteriologische buisjes, bemonsteringsbuisjes en beoordelingsbuisjes en -platen klaargezet. Bereid de set zuiveringsbuisjes als volgt voor: het eerste buisje is leeg en gemarkeerd bij 150 milliliters.Buizen twee tot en met 12 gevuld met 200 milliliters M1 99-medium, aangevuld met menselijk albumine of wasoplossing en gemarkeerd op 230 milliliters. En tot slot één conische buis van 50 milliliter gevuld met 50 milliliters wasoplossing.Zodra deze voorbereidende stappen zijn voltooid, kunnen we beginnen met de preparatie en perfusie van de pancreas. Om te beginnen met de preparatie en perfusie van de pancreas, haalt een operator het orgaan uit de verpakking. Met behulp van een steriele techniek zal de chirurg de pancreas overbrengen naar de decontaminationtafel.De chirurg vult één spuit van 60 cc met de oorspronkelijke pancreasconserveringsoplossing en overhandigt deze aan een operator, die deze gebruikt om de voorbereide bacteriologieflesjes voor procurement te vullen. Na een visuele inspectie om vast te stellen of het orgaan geschikt is voor de isolatie van eilandjes, zal de chirurg een operator vragen om vandaag de collagenase voor te bereiden. Voorbereiden is een choate.Als de pancreas tijdens de winning beschadigd is of anatomisch abnormaal, kan deze niet worden gebruikt voor de isolatie van de eilanden van Langerhans. Houd er rekening mee dat de tijd voor de resuspensie varieert tussen verschillende enzymmerken en partijen. Zodra de chirurg klaar is, brengt u de decontamination-oplossingen naar de decontamination-tafel en schenkt u deze in de juiste containers.De chirurg zal de pancreas aanzuiveren door deze gedurende één minuut te wassen. Vervolgens wordt de pancreas in elk van de aanzuiveringsoplossingen geplaatst in een klein steriel potje, waarin het gewicht wordt bepaald. Nadat het gewicht in het batchrecord is ingevoerd, wordt de pancreas in de canulatiebak geplaatst.Met een conserveringsoplossing legt de chirurg het hoofdkanaal bloot en maakt hij hierin een gedeeltelijke incisie, waarna elk deel van de pancreas wordt gecannuleerd met een canule die met een hechting wordt vastgezet om de pancreas te perfunderen. Plaats het orgaan vervolgens in de perfusie-eenheid en giet de enzymoplossing in het reservoir. De totale perfusietijd bedraagt ongeveer 10 minuten, waarvan vijf minuten bij 80 millimeter kwik.Vervolgens zal de pancreas bij 180 millimeter kwik gedurende vijf minuten opgezet lijken. Verplaats de geperfuseerde pancreas na de perfusie naar de canuleerschaal, waar het vetweefsel zorgvuldig van de pancreas wordt verwijderd. Snijd de pancreas daarna in 10 tot 12 stukken en breng deze over naar de registratiekamer voor digestie.Om te beginnen met de digestiestap, brengt u de pancreas over naar de lege recordkamer. Voeg één flesje van 2,5 ml Pulmozyme toe, zoals op het scherm wordt aangegeven, waarbij u er nauwkeurig op let dat de kamer niet wordt geblokkeerd; sluit de kamer en vul het systeem. Start het pompen van de oplossing gedurende vijf minuten.Beweeg de kamer voorzichtig heen en weer om de warme oplossing gelijkmatig te verspreiden. Schud de kamer na vijf minuten voorzichtig gedurende de gehele digestiefase. Handhaaf de temperatuur op 37 °C.Neem elke twee minuten een monster en stel onder de microscoop vast of er vrije oogjes aanwezig zijn; noteer de informatie van de oogjesevaluatie in de digestietabel van het batchrecord. Blijf het percentage oogjes monitoren tot 50% ervan vrij in de oplossing drijft en geïsoleerd is. Zodra 50% van de oogjes vrij in de monsters wordt aangetroffen, wordt de digestie gestopt door koude RPMI-verdunningsoplossing toe te voegen.Het circuitweefsel wordt opgevangen in kegelvormige buizen van 500 milliliter die vooraf zijn gevuld met 30 milliliter menselijk albumine. Centrifugeer de kegelvormige buizen gedurende één minuut bij 1100 RPM bij vier graden Celsius.Zodra de buizen zijn gecentrifugeerd, wordt het supernatant afgezogen en het pellet gewassen. Combineer alle verzamelbuizen met gesuspendeerd gedigesteerd pancreaatweefsel met behulp van koude wasoplossing in één enkele conische buis van 500 milliliter. Wanneer een buis vol is met gewassen weefsel, wordt deze gecentrifugeerd en het wasproces herhaald totdat al het weefsel meerdere keren is gewassen.Centrifugeer deze buis en breng het weefsel over in één conische buis van 250 milliliter. Vul aan tot een volume van 250 milliliters met M1 99 wasoplossing, aangevuld met humaan albumine, en bereid de monsters voor. Neem met een pipet een monster van één milliliter en voeg dit toe aan een conische buis van 15 milliliter die vooraf is gevuld met negen milliliters wasoplossing.Meng vervolgens door de conische buis van 15 milliliter voorzichtig om te keren. Pipetteer uit dit monster één milliliter direct in een tellijstschaaltje. Tel de cellen en bereken het celgetal.Gebruik een verdunningsfactor van 2.500, centrifugeer de conische buis van 250 milliliter en voeg 150 milliliter uw. University of Wisconsin-oplossing toe. Meng de celсусpensie grondig met de pipet nadat de UW is toegevoegd; noteer dit en breng het over aan de zuiveringsoperator.De starttijd in uw. Laat de buisjes op ijs staan en draai ze af en toe voorzichtig rond. De eilandjes kunnen nu in deze stap verder worden gezuiverd; er wordt een monster van ongezuiverd pancreaatweefsel genomen voor het tellen.Wanneer dione-oplossing aan het monster wordt toegevoegd, zal alleen de eilandjespopulatie rood worden gekleurd. Vervolgens kunnen hun kwaliteit en kwantiteit worden geëvalueerd. We hebben zojuist een procedure gedemonstreerd voor het isoleren van een groot aantal kwalitatieve menselijke pancreaseilandjes, wat essentieel is voor een succesvolle transplantatie van eilandjes.Op basis van onze ervaring moeten we de digestie zo snel mogelijk stopzetten zodra 40 tot 50% van de menselijke eilandjes is vrijgemaakt van het omliggende binnenste weefsel, door het digestiemengsel te verdunnen en af te koelen. Het is daarnaast belangrijk om het weefsel voorzichtig te behandelen tijdens het verzamelen, wassen en mengen. We bevelen de uitstekende zuiveringsmethode van de Universiteit van Chicago aan, die resulteert in een superieur herstel van zeer zuivere menselijke eilandjes.Deze methode verkortte ook de isolatietijd aanzienlijk, waardoor de ischemie-gerelateerde schade aan het eilandje wordt geminimaliseerd. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

human-pancreatic-islet-isolation-part-i-digestion-collection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.

Dissectie van pancreasweefsel om levensvatbare afzonderlijke cellen te isoleren

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer de geautomatiseerde isolatie van menselijke eilandjes van Langerhans voor transplantatiebiologie. Deze methode toont spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel met collageenaseperfusie.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Meer video's verkennen