Name: Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer een efficiënte methode voor de extractie en analyse van plantenhormonen uit kleine weefselmonsters met behulp van gaschromatografie/massaspectrometrie. Deze techniek maakt routinematige monitoring van hormonale veranderingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li> Moeten we eerst de 2 ml schroefdop flesjes voor te bereiden op extractie: Voeg 400ul extractiebuffer (1-propanol: H2O: geconcentreerde HCl 2:1:0.002 vol / vol / vol) en 10 ul van de respectievelijke interne standaard (10ng/μl ) om een ​​flesje. Freeze in vloeibare stikstof en voeg dan de keramische kralen. </li><li> Voeg de plantmateriaal (tussen 50 en 200 mg), terwijl de injectieflacons zijn nog steeds geplaatst in de vloeibare stikstof. Merk op dat het gewicht van de toegevoegde plantaardig materiaal moet geschat worden voor verdere verwerking naar later toe voor de exacte kwantificering, die is gebaseerd op de verse gewicht. </li><li> Zorg ervoor dat alle vloeibare stikstof is verdampt voordat stevig sluiten van de flacon met een dop. Merk op dat de dop dient te beschikken over een rubberen afdichting om morsen van oplosmiddelen en dus onttrokken verbindingen te voorkomen tijdens de homogenisering. </li><li> Homogeniseren het weefsel in een FastPrep of Precellys kraal grinder homogenisator met een snelheid van 6000 (voor Precellys) gedurende 30 sec. </li><li> Verwijder de flacons uit homogenisator individueel, voorzichtig de dop en voeg 1 ml dichloormethaan aan elk monster. Sluit flacons weer strak en homogeniseren weer voor 10-15sec in 6000 (Precellys). </li><li> Overdracht flacons met een tafelblad centrifuge en scheiden de organische fase van de waterige fase bij 10.000xg voor 60sec. </li><li> Na de scheiding van de fasen overdracht van de onderste groene laag (organische fase, bevat de hormonen en de interne standaarden) van individuele flacons op een schoon 4ml glazen flacon. Voorkomen dat de overbrenging van water (bovenste fase). Als alternatief kan ethylacetaat in plaats van dichloormethaan worden gebruikt. In dat geval zal de ethyacetate fase zal de bovenste laag (groen) worden en is nu makkelijker te verwijderen en overgebracht naar een verse 4ml glazen flacon. Net als voorheen, vermijd de overbrenging van water. </li><li> Blaas het oplosmiddel af met lucht door middel van een verzamelleiding voor ongeveer 10-25 minuten (afhankelijk van de steekproef), controleren met een luchtstroom tip indien uit de monsters droog zijn (voorzichtig). Niet Kreukherstellend monsters, kan oorzaak voor dit verlies van verbindingen. </li><li> Zodra de monsters worden gedroogd kunnen we beginnen met de methylering van het carbonzuur-bevattende verbindingen in onze monsters. Eerst worden 100 ul van een diethyether / methanol mengsel (09:01 vol / vol) toegevoegd aan elke flacon, gevolgd door 4μl van een 2M trimethylsilyldiazomethane oplossing (in hexaan, Sigma Aldrich). Flacons zijn direct afgesloten met een open-top schroefdop voorzien van een Teflon beklede siliconen septum. Schud voorzichtig en incuberen bij RT voor 25 tot 30 minuten. </li><li> Na het afronden van stap 9, zet op een verwarmings-blok en ingesteld op de gewenste collectie temperatuur. De volatiliteit van de gemethyleerde verbindingen is afhankelijk van hun grootte, maar ook op andere, meer polaire groepen zoals = O,-OH, en-NH. Voor jasmonzuur en salicylzuur methylesters een verzameling temperaturen van rond de 80 ° C voldoende, terwijl voor bijvoorbeeld andere verbindingen zoals C18-vetzuren, jasmonzuur-aminozuur conjugaten, coronatine, en 12-oxo-phytodienoic acid methyl ester nodig temperatuur tussen 180-200 ° C om effectief te vervluchtigen. </li><li> Na een 30min incubatie van de methylatie reactie moet worden gestopt om ongewenste secundaire reactie te vermijden. Dit wordt gedaan door het toevoegen van 4 pi van een 2M azijnzuur-oplossing (in hexaan) aan elke flacon. Na het sluiten van de flesjes met dopjes en een korte vortexen, worden de monsters mogen incuberen voor een andere 30min. </li><li> De filters worden gebruikt voor deze damp-fase-extractie zijn handgemaakt en in de gepresenteerde vorm niet commercieel beschikbaar. Ze bestaan ​​uit een buitenste Teflon buis (ongeveer 7-8cm lang), waarin de ene kant een goed passende glazen buis van ongeveer 4cm lengte is geplaatst. Aan de andere kant van de Teflon buis een roestvrij stalen schijf wordt gedrukt in de buis tot aan de binnenste glazen buis en op dat ongeveer 20-30mg van adsorbens (hetzij SuperQ 80/100 (uit) of HayeSep ® Q80/100) worden toegevoegd. Nog een roestvrij stalen gaas schijf is geplaatst en tot slot een glas tip is duwt in de teflon buis, waardoor zorgvuldig te drukken op de roestvrij stalen gaas schijf op de absorberende. Een gedetailleerd beeld van een filter is weergegeven in figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. </li><li> Tijdens de incubatietijd van stap 11, de filters voor het verzamelen van de gemethyleerde en dus, vluchtige plantaardige hormonen, moeten worden gewassen het gebruik van eerste 200ul van methanol, en vervolgens 2 wassen met 200ul dichloormethaan elk. Oplosmiddel nog in de filters wordt dan weggeblazen door de lucht. De filters kan nu worden gebruikt voor de vangst van vluchtige hormonen door de damp-phase extractie. </li><li> Na 30min van incubatie de rubber septa van de 4ml afwipdopjes worden gesneden met een scalpel. Naar de fabriek hormonen te verzamelen door damp-fase-extractie de gereinigde filters zijn aangesloten op de individuele vacuüm lijnen met een debiet van ongeveer 800ml/min. De filters worden vervolgens ingebracht in de injectieflacon door het snijden septa. Een kleine pipet tip is ook opgenomen om te fungeren als een luchtinlaat. Tijdens dit eerste deel van de procedure de flesjes met de geplaatste filters moeten worden gehoudenin een rechtopstaande positie op een van de vloeistof in de flacon te vermijden om in contact te komen met de filtertip, die vervuilen het filter en vervolgens ook de GC / MS. De flesjes worden vervolgens in handen van de hand totdat alle vloeistof is verdampt door het filter. Dan is de flacons met de bijbehorende filters zijn geplaatst op de verwarmings-blok en warmte-verdampt verbindingen verzameld voor 3 minuten. Het principe componenten van het systeem en de setup zijn afgebeeld in figuur 1. Na deze laatste damp-fase-extractie stap van de flacons met de filters nog aan worden geplaatst op een rek en laten afkoelen. </li><li> Wanneer de filters hebben op kamertemperatuur weer bereikt zijn ze geëlueerd met 150 ml dichloormethaan in een 1,5 ml GC-flacon voorzien van een insert. Alter uitblazen van het resterende oplosmiddel van het filter de flacons zijn afgedekt en geanalyseerd met behulp van GC / MS. </li></ol> Een gaschromatograaf uitgerust met een split / splitless injector (splitless mode 250 ° C, injectie volume 1μ), gekoppeld aan een massaspectrometer gebruikt in de chemische ionisatie mode (CI) moet worden gebruikt voor de analyse). Verbindingen zijn gescheiden op HP-1MS kolom (30 x 0,25 mm x 025μm) gehouden op 40 ° C voor 1 minuut na de injectie, en dan de temperatuur geprogrammeerd bij 15 ° C / min tot 250 ° C (10min), met helium als de vervoerder gas (constante stroom 0.7ml/min). Voor de MS-analyse zowel een quadropole (bijv. Agilent HP5973) en een ion trap-op basis van (bijv. Varian Saturnus 2200) massaspectrometer kan worden gebruikt. Als een CI gas ofwel isobutaan (komt in gas-tanks) of methanol (dampen van een vloeistof reservoir worden gebruikt) kan gebruikt worden, maar in elk geval de fragmenten van de ionisatie reactie dient te worden gecontroleerd voordat de selected ion count (SIC) programma&#39;s worden gemaakt. Wij hebben gebruik gemaakt van de volgende programma voor een Varian GC 3900/Saturn MS 2200 systeem en methanol als de CI reagens: 5.00-11.30min ionen (M +1) + 153-158 (methylsalicylaat 153, methyl-2 H 5-salicylaat); 11.30-13.30min ionen (M +1) + 207 tot 228 (methyljasmonaat 207 en 225, methyl dihydrojasmonate 209 en 227), 13.30-16.30min ionen (M +1) + 237 tot 300 (methyl abscisinezuur 261, methyl-2 H 6-abscisinezuur 267 (abscisinezuur produceert voornamelijk [MH 2 O +1] + ionen). Alle verbindingen moeten worden vastgesteld door vergelijking met authentieke commercieel verkrijgbare standaarden. Kwantificering van JA, SA, en ABA wordt gedaan door correleren het piekoppervlak (geëxtraheerd ionen) met de piek gebied (gewonnen ionen) van de respectieve interne standaard en is tevens gebaseerd op het verse gewicht van het gebruikte plantmateriaal.

<ol><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li>
<li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li>
<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&acute, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+phytohormones%2C+phytotoxins%2C+and+volatile+organic+compounds+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li>
<li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li>
</ol>

De methode die hier is bewezen betrouwbaar te werken voor een breed scala van planten signaleren stoffen op voorwaarde dat de grootte en de chemische aard van de verbinding niet te voorkomen dat deze uitgepakt, gemethyleerd, en verdampt. Ook de methylering procedure zoals het hier is beschreven is niet de enige manier van derivatisering. Silyllation en acetylering zijn alternatieve methoden en protocollen kunnen eenvoudig online te vinden. Als de massa spectrometer is niet in staat om enkele...

monitoring plantenhormonen tijdens stress reacties

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plantenhormonen en verwante verbindingen signalering speelt een belangrijke rol in de regulatie van plant reacties op de verschillende prikkels uit de omgeving en benadrukt. Een van de meest ernstige spanningen insecten herbivorie, pathogeen infectie, en droogte stress. Voor elk van deze spanningen een specifieke set van hormonen en / of combinaties daarvan is bekend dat fine-tunen van de reacties, waarbij het waarborgen van de plant overleven. De belangrijkste hormonen die betrokken zijn bij de regulering van deze reacties zijn jasmonzuur (JA), salicylzuur (SA), en abscisinezuur (ABA). Om beter inzicht in de rol van de individuele hormonen, alsook hun mogelijke interactie tijdens deze reacties is het noodzakelijk om veranderingen in hun overvloed in een temporele als in een ruimtelijke manier te controleren. Voor de eenvoudige, gevoelige en reproduceerbare kwantificering van deze en andere signalisatie compounds ontwikkelden we een methode gebaseerd op de damp-fase-extractie en gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS) analyse (1, 2, 3, 4). Na het extraheren van deze stoffen uit de plant weefsel door zure waterige 1-propanol gemengd met dichloormethaan het carbonzuur-bevattende verbindingen zijn gemethyleerd, vervluchtigd onder hitte, en verzameld op een polymeer absorberend. Na elutie in een monsterflesje de analyten worden gescheiden door middel van gaschromatografie en gedetecteerd door chemische ionisatie massaspectrometrie. Het gebruik van de juiste interne normen kan vervolgens om de eenvoudige kwantificering van de in verband piekoppervlakten van analyt en de interne standaard.

Een eenvoudige methode is voorzien die het mogelijk maakt voor de snelle extractie en analyse van veelvoudige plantaardige hormonen uit kleine weefselmonsters. De procedure maakt gebruik van dampfase extractie als de plechtige zuiveringsstap. Monsters worden geanalyseerd door GC / MS met chemische ionisatie, die voornamelijk produceert (M +1) + ionen.

Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Plantaardige hormonen en aanverwante signaleringsverbindingen spelen een belangrijke rol bij de regulatie van plantresponsies op diverse omgevingsstimuli en stressfactoren.

Deze procedure begint met de homogenisatie van plantmateriaal met behulp van keramische kraaltjes en een daaropvolgende extractie met dichloramethaan om de organische fase te verkrijgen. Na centrifugatie worden de monsters aan de lucht gedroogd en klaargemaakt voor extractie in de dampfase. Na elutie uit de filters van de dampfase-extractie kan men overgaan tot de analyse van plantenhormonen met behulp van massaspectrometrie en gaschromatografie.Hallo, ik ben Marie Engelberg van het JU Engelberg Lab van de afdeling Biologie aan de University of Texas hier in San Antonio, en ik ben Ju Engelberg. Vandaag laten we u een eenvoudige procedure zien voor de gelijktijdige kwantificering van belangrijke plantenhormonen. Wij gebruiken deze methode routinematig om veranderingen in deze hormonen in planten op de insect reward tech te monitoren.We kunnen ook veranderingen in de vetzuursamenstelling monitoren. Laten we beginnen. Voor de extractie moet u eerst twee milliliters flesjes met schroefdop voorbereiden.Voeg hiervoor 400 µL extractie-oplossing en 10 µL van de respectievelijke interne standaard met een concentratie van 10 ng/µL toe aan een vial. Vries de vials vervolgens in vloeibare stik

monitoring-plant-hormones-during-stress-responses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Er is behoefte aan een niet-invasieve bepaling van stress. Dit document beschrijft een eenvoudig protocol met behulp van thermische beeldvorming om een ​​significante respons in het oog-regio temperatuur in wilde pimpelmezen een milde acute stressor detecteren.

Thermal Imaging Stress Non-invasief in Ongeremde Vogels Studie

Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.

Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

Een eenvoudige, veelzijdige en goedkope in vitro hydrocultuur systeem werd met succes geoptimaliseerd, inschakelen van grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden. Dit systeem vergemakkelijkt de toepassing van chemische stoffen in een oplossing en hun efficiënte absorptie door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies.

Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden

Het doel van dit artikel is om veranderingen in stress niveaus te identificeren na visitatie naar drie verschillende instellingen en om de methoden te beschrijven die worden gebruikt bij het identificeren van stress niveaus op basis van maatregelen van speeksel cortisol, α-amylase en een psychologisch zelf rapport Instrument.

Het meten van biofysische en psychologische stress niveaus na visitatie naar drie locaties met verschillende niveaus van de natuur

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

We ontwierpen een op afbeeldingen gebaseerd fenotyperingsprotocol om de morfologische en fysiologische reacties op enkelvoudige en gecombineerde hitte-, droogte- en wateroverlastbehandelingen te bepalen. Deze aanpak maakte het mogelijk om vroege, late en herstelreacties te identificeren op het niveau van de hele fabriek, met name bovengrondse delen, en benadrukte de noodzaak van het gebruik van meerdere beeldsensoren.

Fenotypering op basis van afbeeldingen met hoge doorvoer voor het bepalen van morfologische en fysiologische reacties op enkelvoudige en gecombineerde spanningen in aardappel

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Leer een efficiënte methode voor de extractie en analyse van plantenhormonen uit kleine weefselmonsters met behulp van gaschromatografie/massaspectrometrie. Deze techniek maakt routinematige monitoring van hormonale veranderingen mogelijk.

Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Meer video's verkennen