Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Deze procedure begint met de homogenisatie van plantmateriaal met behulp van keramische kraaltjes en een daaropvolgende extractie met dichloramethaan om de organische fase te verkrijgen. Na centrifugatie worden de monsters aan de lucht gedroogd en klaargemaakt voor extractie in de dampfase. Na elutie uit de filters van de dampfase-extractie kan men overgaan tot de analyse van plantenhormonen met behulp van massaspectrometrie en gaschromatografie.

Hallo, ik ben Marie Engelberg van het JU Engelberg Lab van de afdeling Biologie aan de University of Texas hier in San Antonio, en ik ben Ju Engelberg. Vandaag laten we u een eenvoudige procedure zien voor de gelijktijdige kwantificering van belangrijke plantenhormonen. Wij gebruiken deze methode routinematig om veranderingen in deze hormonen in planten op de insect reward tech te monitoren.

We kunnen ook veranderingen in de vetzuursamenstelling monitoren. Laten we beginnen. Voor de extractie moet u eerst twee milliliters flesjes met schroefdop voorbereiden.

Voeg hiervoor 400 µL extractie-oplossing en 10 µL van de respectievelijke interne standaard met een concentratie van 10 ng/µL toe aan een vial. Vries de vials vervolgens in vloeibare stikstof in. Voeg na het invriezen de keramische kraaltjes toe aan de vials.

Terwijl de vials nog in vloeibare stikstof geplaatst zijn, voegt u tussen de 50 en 200 milligram plantmateriaal toe. Houd er rekening mee dat het gewicht van het toegevoegde plantmateriaal voorafgaand aan verdere verwerking moet worden geschat om later een exacte kwantificering mogelijk te maken, die gebaseerd is op het versgewicht. Zorg ervoor dat alle vloeibare stikstof is verdampt voordat u de vial stevig met een dop afsluit.

Zorg ervoor dat de dop een rubberen afdichting heeft om morsen van oplosmiddelen en geëxtraheerde verbindingen tijdens de homogenisatie te voorkomen. Homogeniseer het weefsel in een FastPrep- of PSU-beadgrinder. Gebruik bij de PSU-homogenisator een snelheid van 6.000 gedurende 30 seconden.

Zodra de homogenisatie is voltooid, worden de vials individueel uit de homogenisator gehaald. Open de dop voorzichtig om één milliliter dichloormethaan aan elk monster toe te voegen, sluit de vials vervolgens weer stevig en homogeniseer gedurende 10 tot 15 seconden bij 6.000. Na homogenisatie worden de vials naar een tafelcentrifuge overgebracht om de organische fase van de waterige fase te scheiden bij 10.000 ×g gedurende 60 seconden. Na de fasescheiding wordt de onderste groene laag uit de individuele vials overgebracht naar een schone glazen vial van vier milliliter.

Dit is de organische fase die de hormonen en de interne standaarden bevat. Vermijd de overdracht van water of de bovenfase en blaas het oplosmiddel ongeveer 10 tot 25 minuten lang met lucht via een manifold weg. De benodigde tijd is afhankelijk van het monster.

Controleer met een enkele luchtstroompunt zorgvuldig of de monsters droog zijn. Zorg ervoor dat de monsters niet te ver worden gedroogd, omdat dit tot verlies van verbindingen kan leiden. Zodra de monsters zijn gedroogd, kunnen we starten met de methylering van de carboxylzuurhoudende verbindingen in onze monsters.

Voeg eerst 100 µL van een mengsel van diethylether en methanol in een volumeverhouding van negen op één toe aan elk vial. Voeg vervolgens vier µL van een 2 M trimethyldiazomeethaanoplossing in hexaan toe. Sluit de vials onmiddellijk af met een open-top schroefdop voorzien van een Teflon-gevoerd siliconen septum, schud de vials voorzichtig en laat ze 25 tot 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Zet een warmteblok aan en stel dit in op de gewenste opvangtemperatuur. De vluchtigheid van de gemethyleerde verbindingen varieert afhankelijk van hun grootte en het aantal polaire groepen. Temperaturen kunnen variëren tussen 80 en 200 °C. Stop na een incubatie van 30 minuten de methyleringsreactie door vier µL van een 2 M azijnzuuroplossing in hexaan aan elk vial toe te voegen.

Dit wordt gedaan om ongewenste nevenreacties te voorkomen. De filters die worden gebruikt voor de extractie in de dampfase zijn handgemaakt. Ze zijn gemaakt van Teflon-buisjes.

Aan één zijde wordt een goed passende glazen buis van ongeveer vier centimeter lengte ingebracht. De twee schijven van roestvrijstalen gaas, die ongeveer 20 tot 30 mg absorptiemiddel bevatten, zijn zichtbaar. Was de filters die zullen worden gebruikt voor de opvang van de gemethyleerde en vluchtige plantenhormonen met 200 µL methanol.

Was de filters vervolgens tweemaal met 200 µL dichloormethaan. Laat het resterende oplosmiddel op de filters aan de lucht drogen. De filters kunnen nu worden gebruikt voor het opvangen van vluchtige hormonen via dampfasextractie.

Na 30 minuten incubatie van de monsters worden de rubberen septa van de doppen van de vials van vier milliliter met een scalpel doorgesneden. Het geëxtraheerde materiaal is nu gereed om verzameld te worden voor het winnen van plantenhormonen via dampfase-extractie. De gereinigde filters worden aangesloten op individuele vacuümlinies bij een debiet van ongeveer 800 milliliter per minuut.

De filters worden vervolgens via de ingesneden septa in het vial geplaatst. Tevens wordt een kleine pipetpunt ingebracht om als luchtinlaat te dienen. Tijdens dit beginstadium van de procedure moeten de vials met de geplaatste filters rechtop worden gehouden om te voorkomen dat de vloeistof in het vial in contact komt met de filterpunt, aangezien dit het filter zou contamineren.

Vervolgens worden de vials voor de GCMS met de hand vastgehouden totdat alle vloeistof door het filter is verdampt. Daarna worden de vials met de bevestigde filters op het verwarmingsblok geplaatst en worden de door hitte verdampten verbindingen gedurende drie minuten opgevangen. Na deze laatste stap van dampfase-extractie worden de vials met de filters er nog aan op een rek geplaatst om af te koelen.

Bereid 1,5 milliliter GC-vials met inserts voor zodra de filters kamertemperatuur hebben bereikt. Voeg vervolgens een loop van 150 microliters dichloormethaan toe aan de vials. Nadat het resterende oplosmiddel uit het filter is geblazen, worden de vials afgesloten en kunnen ze nu worden geanalyseerd via gaschromatografie-massaspectrometrie.

Voor de analyse wordt een gaschromatograaf gebruikt die is uitgerust met een split-injector gekoppeld aan een massaspectrometer die werkt in chemische ionisatie-modus; na injectie worden de verbindingen gescheiden op een HP one MS-kolom die gedurende één minuut op 40 °C wordt gehouden. De temperatuur is geprogrammeerd met een stijging van 15 °C per minuut tot 250 °C gedurende 10 minuten, met helium als dragergas bij een constante flow van 0,7 mL per minuut. Voor de MS-gebaseerde analyse kan zowel een quadrupool- als een iontrap-massaspectrometer worden gebruikt met een CI-gas.

Er kan gebruik worden gemaakt van isobutaan of methanol. In beide gevallen moeten de fragmenten van de ionisatiereactie echter worden gecontroleerd voordat de geselecteerde iontellingsprogramma's worden aangemaakt. Wij maken gebruik van een variant GC 3, 900 gaschromatograafsysteem gekoppeld aan een Saturn MS 2200 massaspectrometer en methanol als CI-reagens.

Raadpleeg ons geschreven protocol voor een beschrijving van ons programma. Zorg ervoor dat alle verbindingen worden geïdentificeerd door vergelijking met authentieke, commercieel verkrijgbare standaarden. De kwantificering van JA SA en A BA wordt uitgevoerd door de piekoppervlakte van de geëxtraheerde ionen te correleren met de piekoppervlakte van de geëxtraheerde ionen van de respectievelijke interne standaard en is tevens gebaseerd op het natgewicht van het gebruikte plantmateriaal.

Na het extraheren van de gegevens uit de GCM S-bestanden en het uitvoeren van enkele berekeningen, stelden we vast dat ethine aanzienlijke accumulaties van salicylzuur, moniczuur en tevens abiczuur induceerde in vergelijking met onbehandelde controles. De gegevens voor elk individueel hormoon zijn afkomstig uit één enkele run en tonen de capaciteit van deze methode voor multiplex hormoonanalyse aan. We hebben zojuist een eenvoudige maar effectieve procedure gedemonstreerd om belangrijke plantenhormonen en andere signaleringsverbindingen te extraheren en te kwantificeren.

Het is eenvoudig uit te voeren en de meeste van de getoonde hulpmiddelen kunnen gemakkelijk worden gemaakt van standaard laboratoriummateriaal. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.