Name: Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer hoe u synaptische potentialen opwekt aan de neuromusculaire verbinding van Drosophila-larven met behulp van blauw licht-geactiveerde channelrhodopsine2. Deze methode biedt een eenvoudig en kosteneffectief alternatief voor zuigelectrodestimulatie in onderwijs en onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen RO1GM-33205 en de MH-067284 naar LC Griffith en door een Brandeis University zomer undergraduate research beurs NJ Hornstein. Voorlopige experimenten voor deze techniek werden uitgevoerd bij de Marine Biological Laboratory in het kader van de 2008 Neural Systems and Behavior zomer cursus (NIMH te verlenen: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.

Deel 1: Animal zorg en genetische kruisingen <ol><li> Onderhouden UAS-ChR2 en OK371-GAL4 fly-lijnen in aparte flessen die standaard vliegen media 8. </li><li> Verzamel maagden van OK371-GAL4 vliegen lijnen en mannen van UAS-ChR2 lijnen. </li><li> Zet zowel mannen en vrouwen in een flacon met standaard vliegen media gemengd met 1 mM all-trans retinal (ATR). ATR voedsel moet worden gemaakt door eerst smelten reguliere media vliegen in een magnetron voor ~ 1 minuut. Eenmaal gesmolten is, laat het voor ongeveer 30 seconden af ​​te koelen tot een minuut en daarna 100 ul van 100 mM ATR in 100% EtOH voor elke 10 ml van vliegen media toe te voegen. Plaats flacons op het ijs, vervolgens op te slaan in een donkere ruimte bij 4 ° C. </li><li> Laat vliegt paren en leggen eieren in een donkere ruimte bij 22-25 ° C. </li><li> Wacht 3-4 dagen tot de 3de instar larven zichtbaar zijn, op dat moment, beschikken over volwassen vliegen. </li></ol> Deel 2: Rig setup <ol><li> Bevestig een 10x ontleden omvang oog stuk (in ons geval, van Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), met blauwe LED-lichtbron met koellichaam (Thor laboratoria, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Hechten aan magnetische voet met post en klem. Bedek het koellichaam met een elektrisch geaard zijn schild om elektrische ruis gegenereerd door het licht bron te verminderen. </li><li> Plaats magnetische voet met lichtbron op lucht tafel van de elektrofysiologie rig. </li><li> Sluit de lichtbron circuit controle en controle circuit aansluiten op een externe spanningsbron (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO). </li><li> Geef 1 tot 5 V pulsen om circuit controle om blauw licht te activeren. </li><li> Pas de magnetische voet en de lichtbron tot blauw licht bundel is gericht op het gebied dat moet worden ingenomen door larven dissectie. </li></ol> Deel 3: Dissection <ol><li> Plaats zes 0,1 mm insect pennen in de vloer van een Sylgard beklede schaal. </li><li> Verwijder een 3 e instar larven van voedsel media en plaats in een plastic Petri-schaal. </li><li> Spoel larven met een zoutoplossing om voedsel te verwijderen. </li><li> Plaats larven in de buurt van de schotel ontleden getrokken pinnen en voeg zout tot ½ niveau. </li><li> Plaats de larven, zodat u kunt zien twee zilveren buizen (trachea) langs dorsaal van het dier oppervlak. </li><li> Rechtstreeks invoegen een grote pin in de staart tussen de tracheale buizen. Houd de larven naar beneden en plaats een tweede grote pin in zijn hoofd, en zorg ervoor dat het lichaam de lengte uitstrekken. </li><li> Maak een kleine incisie in de buurt van de staart, en ga het op de lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de uiteinden van de schaar zo zijn opgevoed als u niet per ongeluk snijden ventrale zenuwen en / of lichaam muur spieren. </li><li> Plaats vier pinnen op de vier hoeken van het dier nu open buik. Stel ze in het ontleden schotel om zo filet het dier. Pin voorbereiding van geleerd. </li><li> Met behulp van tangen en scharen, verwijder het dier lef, de luchtpijp en vet lichamen. </li><li> Spoel de prep met een zoutoplossing. </li><li> Zoek de frontale kwabben (zoals te zien in figuur A) en ventrale ganglion van de prep. </li><li> Met behulp van micro-schaar, knip voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale kwabben. </li></ol> Deel 4: Muscle opname en blauw licht stimulatie <ol><li> Trek een 10-20 μω elektrode met behulp van een elektronische elektrode trekker (Sutter Instruments). </li><li> Vul de getrokken elektrode met 3 M KCl. </li><li> Plaats gevulde elektrode in elektrode houder en manoeuvreren elektrode met een micromanipulator de buurt van larvale prep onder dissectiemicroscoop op elektrofysiologie rig. </li><li> Identificeer Muscle 6 (M6) in een lichaam muur segment (afb. A). </li><li> Schuif elektrode in M6 en kijk voor een snelle hyperpolarisatie. Muscle rust membraan potentials moeten overal van -30 mV tot -70 mV. </li><li> Stel blauw licht, zodat ontleed prep is gecentreerd in lichtbundel. </li><li> Geef 20-100 ms spanningspulsen naar circuit te controleren. Stapsgewijs te verhogen voltage geleverd aan circuit te controleren. Kijk uit voor excitatoire knooppunt potentieel in de spiercel (Figuur 1B). </li></ol> Representatieve resultaten: Figuur 1A toont een schematische weergave van de opname installatie en gefileerd voorbereiding. Figuur 1B toont typische EJP opgeroepen door korte lichtpulsen. Getoond EJP amplitude is samengevat amplitude van twee motorneuronen bekend bij beide innerveren M6. Lagere lichtintensiteit ingeschakeld slechts een aandrijving (gegevens niet getoond). <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Figuur 1" width="600" height="373" /> Figuur 1: A) Algemeen schema van een intracellulaire opname tuigage en met blauwe LED. Brain (Br) is verwijderd om ritmische activiteit te remmen in de ventrale ganglion (VG). ChR2 wordt uitgedrukt in de motorische neuronen met behulp van de GAL4-UAS-systeem. B) Intracellulaire opname van een M6 spier. 40 ms blauw licht pulsen (op 127 μW / mm 2) op betrouwbare wijze op te roepen grote synaptische potentialen (sterretjes) in M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

We hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Kritische stappen omvatten zowel de initiële dissectie en het invoeren van spiercellen. Als zenuwen zijn doorgesneden of spier is beschadigd tijdens de eerste dissectie is het moeilijk om door te gaan de rest van het experiment. Tijdens de dissectie, moet men zeer voorzichtig te ontleden schaar omhoog zoveel mogelijk hoek tijdens de dorsale incisie. Tijdens de tweede cruciale stap, het invoeren van een spiercel, moet men kijken naar een hyperpolarisatie verleden ~ 30 mV. Waarden boven de -30 mV geven aan dat de elektrod...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Minutens-pinnen</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissectieschaal</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe intracellulaire versterker en head stage</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 data-acquisitiesysteem&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass-stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Desktopcomputer</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vliegmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-Trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; vliegen</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; vliegen</td><td>Fiala lab, Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED-controllercircuit</td><td>Gebouwd in Griffith lab</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Bestaande uit: &lt;br/&gt;1. 200 mA Buck Puck&lt;br/&gt;2. Blauwe LED&lt;br/&gt;3. Geïsoleerd draad&lt;br/&gt;4. Circuit breadboard&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED-koellichaam</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Luchttafel</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday-kooi</td><td>Gebouwd in Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M micro-manipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrodehouder</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Elektrodetrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>HL 3.1 zoutoplossing met 0.8mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>Inhoud (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Sucrose:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehalose: 5 HEPES</td></tr><tr><td>Microdissectiegereedschap</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 mediated stimulatie van synaptische potentials op drosophila neuromusculaire verbindingen

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuromusculaire voorbereiding heeft zich bewezen als een nuttig instrument voor het bestuderen van synaptische fysiologie worden<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Momenteel is de enige beschikbare middelen prikkelend junctionele potentials (EJPs) op te roepen in dit preparaat omvat het gebruik van de zuigkracht elektroden. In zowel onderzoek als onderwijs labs, studenten vaak moeite hebben om te manoeuvreren en manipuleren van dit soort stimulerende elektrode. In dit werk, laten we zien hoe op afstand synaptische potentialen te stimuleren op het larvale NMJ zonder het gebruik van zuigkracht elektroden. Met het uitdrukken van channelrhodopsin2 (ChR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; In<em&gt; Drosophila</em&gt; Motorneuronen het gebruik van de<em&gt; GAL4-UAS</em&gt; Systeem<sup&gt; 7</sup&gt;, En het maken van kleine wijzigingen in een basic rig elektrofysiologie, waren we in staat om een ​​betrouwbare EJPs roepen met pulsen van blauw licht. Deze techniek kan van bijzonder het gebruik in het onderwijs neurofysiologie laboratoria waar de student rig praktijk tijd en middelen zijn beperkt.

Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ) in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Deze techniek is een goedkoop en makkelijk te gebruiken alternatief voor zuigkracht elektrode stimulatie voor synaptische fysiologie studies in onderzoek en onderwijs laboratoria.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

De neuromusculaire preparatie van Drosophila-larven is een nuttig instrument gebleken voor het bestuderen van de synaptische fysiologie1,2,3. Momenteel is het enige beschikbare middel ...

Deze procedure begint met het kweken van drosophila. Derde-instar larven met het juiste genotype worden gekweekt op voedsel dat all-trans retinol bevat. Elke larve wordt met spelden bij de kop en de staart vastgezet.Vervolgens wordt de FLA platgelegd. De hersenen en posterieure zenuwen worden daarna doorgesneden om ritmische motorische activiteit te stoppen. Daarna wordt de blauwe LED-lichtbron met controlebox ingesteld en gefocust op het preparaat.Gebruik ten slotte een scherpe elektrode om spier zes te doorboren. Dien vervolgens lichtpulsen toe met een spanningsbron. Hallo, ik ben Nicholas Marstein van het laboratorium van Dr. Leslie Griffith, van de afdeling Biologie aan de Brandeis University.Hoi, ik ben Stefan Pulver, ook van het Griffith Lab. Vandaag laten we u de procedure zien voor het opwekken van synaptische potentialen met channel root absent two bij de neuromusculaire junctie van drosophila-larven. We gebruiken deze procedure in ons lab om de synaptische fysiologie in drosophila te bestuderen.We gebruiken het ook om studenten synaptische fysiologie en onderwijslaboratoria te doceren. Laten we beginnen. Om met dit protocol te starten, houdt u UAS channel redsin two en okay, 3 7, 1 gal four vliegenlijnen in afzonderlijke flesjes met standaardvliegmedium.Verzamel maagden uit de, oké, 3 7, 1 gal, vier vliegenlijnen en mannetjes uit de UAS channel redsin. Twee lijnen. Maak vervolgens vliegenmedium dat is gemengd met 1 millimolair all-trans-retinol of ATret. Smelt hiervoor regulier vliegenmedium ongeveer één minuut in een magnetron.Laat het medium, zodra het gesmolten is, ongeveer 30 tot 60 seconden afkoelen en voeg vervolgens 100 µL van 100 mM a TR in 100% ethanol toe voor elke 10 mL vliegenmedium. Wanneer de vials met TR-medium klaar zijn, plaatst u de verzamelde mannetjes en vrouwtjes in elke vial. Plaats de vials in een donkere ruimte bij 22 tot 25 °C zodat de vliegen kunnen paren en eitjes kunnen leggen; wacht vier tot vijf dagen tot de derde instar-larven zichtbaar zijn.Op dit punt kunnen de volwassen vliegen worden afgevoerd. We zijn nu klaar om verder te gaan met de opstelling van de elektrofysiologische rig. Bevestig elk oculair van de dissectiemicroscoop aan een blauwe LED-lichtbron met een koellichaam.Gebruik een standaard en klem om een magnetische basis aan het oculair en de LED-lichtbron te bevestigen. Plaats de magnetische basis op de luchttafel van de elektrofysiologische opstelling. Sluit vervolgens de lichtbron aan op een regelcircuit en verbind dit regelcircuit vervolgens met een externe spanningsbron.We gebruiken de spanningsuitgang van het PowerLab-elektrofysiologische gegevensacquisitiesysteem van AD Instruments. Zodra dit is aangesloten op de spanningsbron, worden pulsen van één tot vijf volt aan het besturingscircuit gegeven om het blauwe licht te activeren. Pas de magnetische voet en de lichtbron aan totdat de blauwe lichtbundel is gefocust op het gebied waar de dissectie van de larve zal plaatsvinden. Nadat de juiste aanpassingen zijn gemaakt, kunnen we overgaan naar de dissectie van de larve.Om te beginnen met de dissectie, plaatst u zes spelden van 0,1 millimeter in de bodem van een schaal bekleed met agar. Verwijder een derde-instadium larve uit het voedingsmedium en plaats deze in een plastic Petri-schaal. Spoel de larven met zoutoplossing om eventueel aan de larven klevend voedsel te verwijderen.Plaats vervolgens de larven in de dissectieschaal nabij de gebogen spelden en vul de schaal voor de helft met zoutoplossing. Orienteer de larven nu zodanig dat u twee zilverachtige buisjes kunt zien die over het dorsale oppervlak van het dier lopen. Deze zilverachtige buisjes zijn de trachea.Steek een grote speld direct in de staart tussen de tracheaalbuizen. Houd de larven vast en plaats een tweede grote speld in de kop. Zorg ervoor dat het lichaam in de lengte wordt uitgerekt terwijl de speld wordt ingevoerd.Gebruik een schaar om een kleine incisie nabij de staart te maken. Zet de incisie voort over de gehele lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de schaarpunten omhoog gericht zijn om te voorkomen dat de ventrale zenuwen en/of de spieren van de lichaamswand worden doorgesneden.Plaats vier pinnen in de vier hoeken van de dieren. Open nu het middendeel. Zet de pinnen in de dissectieschaal zodat het dier wordt uitgespreid.Zet het preparaat vervolgens vast zodat het met een pincet en schaar kan worden behandeld. Verwijder de spijsverteringsorganen, de trachea en de vetlichamen van het dier. Spoel het preparaat met zoutoplossing.Lokaliseer na het spoelen de frontale kwabben en het ventrale ganglion van het preparaat met behulp van microscharen. Snijd voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale kwabben. Zodra de dissectie is voltooid, kan worden overgegaan tot de stimulatie met blauw licht en de spierregistratie.Om de spierregistratie uit te voeren, wordt een elektrode met een weerstand van 10 tot 20 mega ohm getrokken. Vul de getrokken elektrode met drie molair KCL met behulp van een elektronische elektrodetrekker. Plaats de gevulde elektrode in de elektrodehouder.Plaats nu de larvenpreparaat op de opstelling onder een dissectiemicroscoop. Stel het blauwe licht zo in dat het gedissecteerde preparaat in het midden van de lichtbundel staat. Identificeer spier zes of M zes in een willekeurig segment van de lichaamswand van de larve; breng met een micromanipulator voorzichtig de elektrode in M zes aan en let op een snelle hyperpolarisatie van de spier.Rustmembraanpotentialen moeten liggen tussen de -30 millivolt en -70 millivolt. Zodra de elektrode correct is ingebracht, worden er spanningspulsen van 20 tot 100 milliseconden aan het regelcircuit gegeven. Verhoog de aan de regelkring geleverde spanning stapsgewijs.Let op het optreden van excitatieve junctiepotentialen in de spiercel. Hier is een representatief resultaat dat een excitatieve junctiepotentiaal laat zien die is opgewekt door korte lichtpulsen. De hier getoonde amplitude van de excitatieve junctiepotentiaal is de gesommeerde amplitude van twee motorneuronen waarvan bekend is dat beide activeren.M zes. Lagere intensiteiten of kortere lichtduuraties kunnen het excitatoire junctiepotentiaal met een kleinere amplitude van een enkel motorisch neuron blootleggen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u kanaalrhodopsine-2-gemedieerde stimulatie van synaptische potentialen bij de oph-neuromusculaire junctie uitvoert.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de lichaamswand van het preparaat tijdens de dissectie niet te beschadigen. Onthoud ook dat een preparaat direct na een dissectie overgeëxciteerd kan zijn, maar dat het na verloop van tijd zal kalmeren, wat goede opnames mogelijk maakt. Wees bij het impaleren van spieren voorzichtig om niet voorbij de eerste spierlaag door in de lichaamswand te gaan.Wanneer uw elektrode in de lichaamswand vastzit, kunt u soms hypergepolariseerde potentialen verkrijgen zonder dat u zich daadwerkelijk in een spiercel bevindt. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

This video demonstrates the technique for recording synaptic currents from a synaptic bouton at the Drosophila larva's neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton, which is important for the study of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Recording Synaptic Currents at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hier een protocol beschrijven we voor optogenetic manipulatie van motoneuronal activiteit, terwijl het volgen van veranderingen in motorvermogen (spiercontractie) in...

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) is een precisietechniek voor het functioneel in kaart brengen van lange afstandneuronale projecties tussen anatomische en/of genetisch geïdentificeerde groepen neuronen. Hier beschrijven we hoe we CRACM kunnen gebruiken om auditieve hersenstamverbindingen in kaart te brengen, inclusief het gebruik van een roodverschoven opsin, ChrimsonR.

Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Leer hoe u synaptische potentialen opwekt aan de neuromusculaire verbinding van Drosophila-larven met behulp van blauw licht-geactiveerde channelrhodopsine2. Deze methode biedt een eenvoudig en kosteneffectief alternatief voor zuigelectrodestimulatie in onderwijs en onderzoek.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

Meer video's verkennen