Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

Deze procedure begint met het kweken van drosophila. Ten derde, maggots in de derde instar met het juiste genotype op voedsel dat all trans retinol bevat. Elke larve wordt met een speld vastgezet, kop en staart.

Vervolgens FLA plat. De hersenen en achterste zenuwen worden vervolgens doorgesneden om de ritmische motorische activiteit te stoppen. Vervolgens wordt de blauwe LED-lichtbron met bedieningsbox aangepast en gericht op de bereiding.

Ten slotte gebruik je een scherpe elektrode om spier zes te doorboren. Lever vervolgens lichtpulsen met een spanningsbron. Hallo, ik ben Nicholas Marstein van het lab van Dr. Leslie Griffith, het Departement Biologie aan de Brandeis University.

Hallo, ik ben Stefan Pulver, ook van het Griffith Lab. Vandaag laten we je de procedure zien voor het oproepen van synaptische potentialen met kanaalwortel afwezig twee bij de neuromusculaire kruising van drosophila-larven. We gebruiken deze procedure in ons lab om synaptische fysiologie en drosophila te bestuderen.

We gebruiken het ook om studenten synaptische fysiologie en leslabs te leren. Dus laten we beginnen. Om te beginnen met dit protocol, onderhoud UAS-kanaal rodesin twee en oké, 3 7, 1 gal vier vlieglijnen in afzonderlijke flessen met standaard vliegmedium.

Verzamel maagdelijken van de, oké, 3 7, 1 gal, vier vlieglijnen en mannetjes van de UAS-kanaal rodesin. Twee lijnen. Maak vervolgens vliegmedium dat gemengd is met één millimolair, all trans retinol of een TR. Om dit te doen, smelt regelmatig vliegmedium in een magnetron gedurende ongeveer één minuut.

Eenmaal gesmolten, laat het medium ongeveer 30 tot 60 seconden afkoelen en voeg vervolgens 100 microliters van 100 millimolair a TR in 100% ethanol toe voor elke 10 milliliter vliegmedium. Wanneer de flacons met TR-medium klaar zijn, plaats de verzamelde mannetjes en vrouwtjes in elke flacon. Plaats de flacons in een donker gebied op 22 tot 25 graden Celsius om de vliegen te laten paren en eieren te leggen. Wacht vier tot vijf dagen tot de derde instar-larven zichtbaar zijn.

Op dit punt kun je de volwassen vliegen weggooien. We zijn nu klaar om verder te gaan met de opbouw van het elektroffysiologie-apparaat. Bevestig een willekeurig dissectoscoop-oogstuk aan een blauwe LED-lichtbron met een warmteafvoer.

Gebruik een post en klem om een magnetische basis aan het oogstuk en de LED-lichtbron te bevestigen. Plaats de magnetische basis op de luchttafel van het elektroffysiologie-apparaat. Verbind vervolgens de lichtbron met een besturingscircuit en verbind het besturingscircuit met een externe spanningsbron.

We gebruiken de spanningsuitvoer van het Power Lab elektrofysiologie data-acquisitiesysteem gemaakt door AD Instruments. Eenmaal verbonden met de spanningsbron, geef één tot vijf volt pulsen naar het besturingscircuit om het blauwe licht te activeren, pas de magnetische basis en de lichtbron aan tot het blauwe lichtstraal is gericht op het gebied dat wordt ingenomen door de larvale dissectie. Na het maken van de juiste aanpassingen, zijn we klaar om verder te gaan met de larvale dissectie.

Om te beginnen met de dissectie, plaats zes 0,1 millimeter pinnen in de bodem van een zogenaamde lijn schaal. Verwijder een derde in star larve uit het voedingsmedium en plaats het in een willekeurige plastic petrischaal. Spoel de larven met zoutoplossing om voedsel dat aan de larven is gehecht te verwijderen.

Plaats vervolgens de larven in het dissectieschaaltje naast de getrokken pinnen en vul het schaaltje half met zoutoplossing. Richt de larven nu zo dat je twee zilverachtige buizen langs het dorsale oppervlak van het dier kunt zien. Deze zilverachtige buizen zijn de luchtpijpen.

Steek een grote speld direct in de staart tussen de tracheale buizen. Houd de larve naar beneden en plaats een tweede grote speld in het hoofd. Zorg ervoor dat het lichaam tijdens het inbrengen van de speld in de lengte wordt uitgerekt.

Gebruik een schaar om een kleine insnijding te maken nabij de staart. Vervolg de insnijding over de lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de punten van de schaar omhoog worden gehouden om te voorkomen dat de ventrale zenuwen en/of lichaamswandspieren worden doorgesneden.

Plaats vier pinnen op de vier hoeken van het dier. Open nu het middengedeelte. Plaats de pinnen in het dissectieschaaltje om het dier te fileren.

Speld ook de voorbereiding zo vast dat deze strak is met behulp van een pincet en schaar. Verwijder de spijsverteringsorganen, luchtpijpen en vetlichamen van het dier. Spoel de voorbereiding met zoutoplossing.

Na het spoelen, lokaliseer de frontale lobben en het ventrale ganglion van de voorbereiding met behulp van microschaar. Snijd voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale lobben. Zodra de dissectie is voltooid, gaat u verder met de blauwe lichtstimulatie en spierregistratie.

Om de spierregistratie uit te voeren, trek een 10 tot 20 megaohm weerstandselektrode. Vul de getrokken elektrode met drie molaire KCL. Plaats de gevulde elektrode in de elektrodehouder.

Plaats nu de larvale voorbereiding onder een dissectiemicroscoop op het apparaat. Pas het blauwe licht aan zodat de gedissecteerde voorbereiding centraal in de lichtstraal staat. Identificeer spier zes of M zes in een willekeurig lichaamswandsegment van de larve met behulp van een micro manipulator, steek voorzichtig de elektrode in M zes en kijk naar snelle hyperpolarisatie van de spier.

Rustmembraanpotentialen moeten tussen de negentig millivolt en de negentig millivolt liggen. Zodra de elektrode goed is ingebracht, geef 20 tot 100 milliseconde spanningspulsen aan het besturingscircuit. Verhoog geleidelijk de spanning die aan het besturingscircuit wordt geleverd.

Let op excitatie-knooppuntpotentialen in de spiercel. Hier is een representatief resultaat dat een excitatie-knooppuntpotentiaal toont die is opgewekt door korte lichtpulsen. Het excitatie-