Fabricage van myogene Engineered Tissue constructen

Deze procedure begint met het oogsten van skeletspierweefsel van neonatale Lewis Wraths. Uit dit weefsel isoleren we myoblastcellen. Deze myoblasten worden gedurende twee dagen gekweekt in weefselkweekschalen, waarna ze worden geoogst en gemengd in een mengsel voor een weefselconstruct op basis van collageen.

Dit mengsel wordt zorgvuldig met een pipet in een mal overgebracht die is ondergedompeld in kweekmedium en vervolgens geïncubeerd bij 37 °C. Hallo, ik ben Christina Pesach van het laboratorium van Douglas Cowan van de afdeling Anesthesiologie van het Children's Hospital, Boston en de Harvard Medical School. Vandaag laten we u een procedure zien voor het creëren van myogeen engineered weefsel.

We gebruiken deze procedure om weefsel te fabriceren voor inplanting in het hart. Ons doel is om een elektrische verbinding te creëren tussen de bovenste en onderste hartkamers als alternatieve therapie voor de implantatie van een pacemaker bij kinderen met een volledige hartblokkade. Laten we beginnen.

In het construct wordt een gietvorm gebruikt om vorm te geven aan het chirurgisch implanteerbare weefselconstruct op basis van collageen. In deze video wordt het proces voor het creëren van engineered weefselconstructen met skeletmyoblasten beschreven in een begeleidende video. De cardiale implantatie van het gecellulariseerde weefsel dat via dit protocol is gemaakt, wordt gedemonstreerd.

Een weefselmal kan in vrijwel elke vorm of grootte worden gemaakt om te voldoen aan de fysiologische vereisten van elk hart waarvoor het weefsel is ontworpen. In deze demonstratie vormt de mal een stuk weefsel dat kan worden gesneden om in de AV-groef van een hart van een volwassen rat te passen. Begin met het vervaardigen van de mal door met een scheermesje de siliconen slang in stukken van drie centimeter te snijden en vervolgens elk stuk in de lengte doormidden te snijden.

Knip een klein stukje polyestergaas af. Breng vervolgens een druppel RTV-siliconenlijm van implantaatkwaliteit aan op de binnenzijde van het uiteinde van de buis. Probeer de hoeveelheid aangebrachte lijm tot een minimum te beperken, aangezien deze enigszins toxisch is voor gekweekte cellen.

Plaats snel een klein stukje polyester gaas op de druppel siliconenlijm en richt dit uit met het uiteinde van de slang. Dit zorgt voor een licht verhoogd en vlak oppervlak voor de bevestiging van het construct. Herhaal dit proces voor het andere uiteinde van de slang.

Laat de mal drie dagen drogen bij kamertemperatuur. Het is handig om in één keer 20 tot 30 mallen te maken, aangezien deze in feite wegwerpartikelen zijn. Zodra de lijm volledig is gedroogd, bewaar je de mallen in een bak met 70% ethanol om ze te steriliseren tot het moment dat de voorbereide mallen nodig zijn.

Stel vervolgens vast of alle benodigde oplossingen ook klaar voor gebruik ter voorbereiding op de celisolatie. Maak een verdunde laminine-oplossing van 1 mg laminine in 250 mL 0,2 micron gefiltreerde, gesteriliseerde PBS met antibiotica en een fungicide.

Bedek vervolgens 150 millimeter weefselkweekplaten met vier milliliters van de verdunde laminine-oplossing en incubeer deze bij 37 degrees Celsius gedurende ten minste vier uur voor gebruik. Er moeten ook twee andere oplossingen worden bereid: het myoblastmedium en de skeletspierdigestie-oplossing.

Raadpleeg het tekstgedeelte van het protocol voor de formuleringen. Steriliseer de digestiebuffer door gebruik te maken van een filterdisc van 0,2 micron op een spuit van 10 milliliter. Aliquoten van de digestiebuffer kunnen worden bewaard bij -20 °C.

Reken erop dat u vijf milliliters digestiebuffer per nest Lewis-ratten nodig heeft. Incubeer de benodigde hoeveelheid weefseldigestiebuffer en 10 milliliters myoblastmedium bij 37 degrees Celsius. Ga vervolgens over tot het dissekeren van de ratpups.

Verkrijg eerst ten minste één nest van geofferde neonatale Lewis-ratten met behulp van een pincet en een klein schaartje. Verwijder de paraspinale spieren van de dode neonatale Lewis-ratten door langs het ruggenmerg over de rug in te snijden, de huid- en fasciatlagen terug te pellen en vervolgens de spieren uit te snijden. Plaats de uitgesneden spieren in een conische buis van 50 milliliter gevuld met 40 milliliter van één X-H-B-S-S op ijs.

Laat de spierstrips naar de bodem van de buis zakken en verwijder voorzichtig het grootste deel van de vloeistof en bloedresten door vacuümsuctie met een steriele Pasteurpipet in een kweekbak. Giet vervolgens de geoogste stukjes spierweefsel op een kweekschaal van 150 millimeter en aspireer zoveel mogelijk van de resterende vloeistof weg. Hak het weefsel met twee enkelzijdige scheermesjes fijn tot een dikke pasta.

De spierpasta wordt gedigereerd in voorverwarmde digestie-oplossing. Giet een deel van de digestie-oplossing op de spierpasta en breng het mengsel van de oplossing en de spierpasta over naar een schone buis van 50 milliliter. Met gebruik van een 10 milliliter pipet gebruiken we over het algemeen 10 tot 15 milliliter oplossing voor een efficiënte digestie van spieren van Lewis-ratten van drie liter.

Plaats de buis op een schudplatform en verteer bij 37 °C gedurende ongeveer 30 minuten. Tijdens de enzymatische digestie wordt het weefsel af en toe getritureerd zonder belletjes te vormen. Gebruik hiervoor een pipette van 10 mL die is bevestigd aan een draadloze pipeteersysteem.

Zodra de spier is gehomogeniseerd, wordt de oplossing door een cellzeef van 70 micron gefilterd. Centrifugeer vervolgens de gefilterde cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 600 G. Gebruik een Pasteurpipet en zuig zoveel mogelijk van het vloeistofdeel af en resuspendeer de pellet in 10 milliliters warm myoblast-medium. Laat de cellen 15 minuten rusten op een ongecoate weefkweekplaat van 150 millimeter om fibroblasten te helpen verwijderen, aangezien deze sneller hechten dan myoblasten.

Plaats de plaat in een bevochtigde incubator ingesteld op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Haal de plaat uit de incubator en transfer de cellen die nog niet zijn gehecht aan de met laminine gecoate cultuur. Was en verdun ze in myoblastmedium, zodat er één plaat beschikbaar is voor elke één tot twee rattenpups.

Als de cellen te dicht worden gezaaid, zullen ze differentiëren tot myotubes. Laat de cellen tot slot groeien in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Na één tot twee dagen incubatie zijn de cellen klaar om te worden gegoten in weefselconstructen.

Haal na één tot twee dagen incubatie vier van de 150 millimeter weefselkweekplaten met myoblasten uit de incubator. Wacht niet langer dan 48 uur, anders zullen fibroblasten de myoblastpopulatie overvleugelen. Aspireer het medium van de cellen.

Spoel de cellen vervolgens twee keer met 1 mL XPBS, voorverwarmd tot 37 °C, om de myoblasten van de plaat los te maken, voeg vier milliliter voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke plaat en plaats de platen gedurende vijf minuten terug in de incubator. Oogst de myoblasten in de cultuurkap en verzamel de vloeistof in een buis van 50 milliliter. Gebruik 10 milliliter myoblastmedium om alle platen te spoelen en voeg dit samen met de cellen in de centrifugebuis.

Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 600 G om een pellet te vormen en aspireer zoveel mogelijk van het overtollige vloeistof weg. Resuspendeer de myoblasten vervolgens in 1,4 milliliters myoblastmedium en plaats ze op ijs. Verwijder met een pincet voorzichtig een constructmal uit het ethanolbad en spoel deze twee keer door onderdompeling in XPBS; aspireer alle sporen van PBS met een Pasteurpipet voordat de mal in een lege put van een zes-putts weefselkweekplaat wordt geplaatst.

Op dit moment moet een oplossing worden bereid. Verzamel de volgende reagentia op ijs. 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

Type one collageencellen resuspenderen in myoblastmedium, natriumbicarbonaat en gel. Combineer de reagentia volgens het beschreven protocol. Vortex het mengsel gedurende 20 seconden totdat het roze wordt.

Houd er rekening mee dat de commercieel beschikbare varianten van type I collageen een variabel effect hebben op de menging, stolling en consistentie van het eindproduct. Plaats de buis enkele minuten terug in het ijsbad om de luchtbellen uit de oplossing te verwijderen.

Het is van belang dat het type I collageen niet wordt bestraald, anders zal het niet gelatiniseren. Hier gebruiken we een product afgeleid van eihuid. Giet het mengsel voorzichtig in de mal in de kweekplaat voordat het mengsel stolt.

Elke mal kan ongeveer één milliliter van de viskeuze vloeistof bevatten. Probeer tijdens deze procedure het introduceren van luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat met de constructmalen voorzichtig in de incubator op 37 °C.

Terwijl het mengsel stolt, verandert de kleur van donkerroze naar lichtroze; terwijl de vorm stolt, wordt wat myoblastmedium opgewarmd tot 37 °C. Na ongeveer een half uur incubatie wordt elk weefselconstruct voorzichtig ondergedompeld in het verwarmde myoblastmedium en wordt de plaat teruggeplaatst in de incubator. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, is het myoblastbevattende weefselconstruct klaar voor in vivo implantatie of voor verdere analyses.

Na twee dagen incubatie hebben we u zojuist laten zien hoe u een myogeen weefseltechnisch construct kunt vervaardigen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle reagentia die nodig zijn voor de constructie-oplossing op ijs moeten worden bewaard om voortijdige stolling te voorkomen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.