Name: Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer optische mapping van actiepotentialen op het oppervlak van Langendorff-geperfuseerde rattenharten met di-8-ANEPPS. Deze hoge-resolutiemethode maakt gedetailleerde studie van cardiale elektrische activiteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (HL068915, HL088206) en bijdragen aan het hartgeleiding Fonds op Children&#39;s Hospital Boston.

Deel 1: Bereid oplossingen en de geïsoleerde doorbloede hart-systeem <ol><li> Op de ochtend van het experiment, is 4,0 L van Krebs-Henseleit oplossing, bereid zoals eerder beschreven [5, 6]. </li><li> 11 mmol / l 2,3-butaandion monoxime (BDM) wordt opgelost in 1,0 L van Krebs-Henseleit oplossing gedecanteerd van het perfusaat bereid in stap 1.1. </li><li> Een extra 150 ml Krebs-Henseleit is verwijderd uit het perfusaat bereid in stap 1,1 en gemengd met 5 Mol / L di-8-ANEPPS (verdund uit een 10 mmol / L voorraad opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)). </li><li> Deze drie oplossingen worden overgebracht naar watermantel glas reservoirs (Radnoti), waar ze worden voorverwarmd tot 41,0 ° C en zuurstof met een verzonken bubbler (Radnoti) met behulp van 0,2 micrometer-gefilterde 95% O 2, 5% CO 2 gas. Oplossingen van de 3 voorraad reservoirs worden gepompt aan de muur gemonteerde Langendorff systeem met Masterflex ™ L / S peristaltische pompen en een lage absorptie van silicone tubing (Cole-Parmer). </li><li> Voorafgaand aan de montage, is het Langendorff systeem glaswerk (Radnoti) zorgvuldig gewassen met E-Toxa-CLEAN reagens (Sigma-Aldrich) en grondig gespoeld met 0,1 M / L HCl, 100% ethanol, en gedestilleerd water. </li><li> De niet-recirculerende Langendorff apparaat was gebouwd om 70 mm Hg constante druk van 3 verschillende zuurstof reservoirs, die uit het hart van elkaar gescheiden door watermantel verwarmingsspiralen en bubble vallen leveren (Radnoti) [7]. De drie onafhankelijke perfusie lijnen samenkomen boven het hart op twee 3-weg kranen, zodat we nauwkeurig te regelen levering van de oplossingen bereid in stappen 1,1 tot 1,3. Watermantel glaswerk is in serie geschakeld met MASTERFLEX PharMed BPT buis (Cole-Parmer) en verwarmd tot 39 ° C met gedestilleerd water met behulp van twee circulatiepompen E100 (Lauda). Warmteverlies via de platina behandelde silicone pompslang (Cole-Parmer) dat de druk-hoofd reservoirs verbindt met de verwarmingsspiralen en bubble vallen resulteerde in een 37 ° C perfusaat het bereiken van het hart. </li></ol> Deel 2: Oogst de rat hart en de set-up Langendorff perfusie <ol><li> Om een ​​diepe algemene gevoelloosheid veroorzaken in 200-250 g Lewis ratten, is 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg Xylazine geïnjecteerd in de intraperitoneale holte. Aan dit mengsel, voegen we 500 U / kg Heparine om de bloedstolling en myocardischemie te voorkomen tijdens de explantatie procedure. </li><li> Voor eenvoudige toegang tot het hart en de grote vaten, is de voorste borstwand verwijderd. Daarna wordt het omringende weefsel zorgvuldig ontleed en de pericardiale zak geopend. </li><li> Na identificatie van de vena cava inferior, is dit schip afgebonden met 5-0 zijde (Ethicon) en de gehele hart-long block is geëxplanteerd. Weefsel wordt direct geplaatst in ijskoude Krebs-Henseleit oplossing in een 50 mL bekerglas op ijs. </li><li> De opgaande aorta is snel geïdentificeerd en ontleed van het omringende weefsel. Een voldoende grote canule (Harvard Apparatus) wordt ingebracht in de aorta, zorg om te voorkomen dat het onderbreken van de verplichte perfusie van de kransslagaders door het inbrengen van de canule te ver in de aorta wortel. De canule is bevestigd aan de aorta ascendens met 5-0 zijde (Ethicon). </li><li> De rat hart wordt dan geplaatst op het Langendorff apparaat zonder dat er luchtbellen in de canule. Retrograde coronaire vasculaire perfusie is nu gevestigd aan de warme, zuurstofrijke Krebs-Henseleit oplossing uit de druk-head beschreven in stap 1.6. </li><li> Extra weefsel, waaronder de longen, is nu verwijderd en het hart is perfusie gedurende 20 minuten tot herstel van functie mogelijk te maken en het ritme te stabiliseren. Gedurende deze tijd, is een zeer dunne thermokoppel temperatuurvoeler (Cole-Parmer) ingebracht in de linker ventrikel holte en gehecht op zijn plaats met 5-0 Prolene hechting (Ethicon). De sonde is verbonden met een thermo-controller (Digi-Sense) om de temperatuur van het hart verzekeren wordt gehandhaafd op 37 ° C door het aanpassen van de instellingen van het water bloedsomloop pompen. Beweging van perfusaat druipen van de hart-top wordt geminimaliseerd door het plaatsen van een gaasje in het effluent bakje. </li></ol> Deel 3: Laad hart met potentiometrische kleurstof en het verwerven elektrografisch en optische signalen <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) wordt geladen in het hart door over te schakelen naar de perfusie regel met de Krebs-Henseleit gemengd met de fluorescente kleurstof met behulp van een kraan. Daarnaast wordt een canule 18G geplaatst in de linker-en / of rechts atrium en extra 50 ml kleurstof oplossing wordt langzaam toegediend in elk van deze kamers, omdat ze niet voldoende geperfuseerd met kleurstof geïntroduceerd door de kransslagaders. </li><li> Tijdens het laden procedure worden drie ECG leads (Harvard Apparatus) voorzichtig geplaatst op het oppervlak van het hart dat niet is geconfronteerd met de optiek gebruikt voor mapping. Elektrode N o 1 is geplaatst op het achterste apicale deel van de linker ventrikel, N o 2 aan de linker atrium, en N <su<html> p&gt; o 3 als een referentie-elektrode op de aorta wortel (figuur 1). De atriale en ventriculaire elektrografische signalen worden vervolgens versterkt, gedigitaliseerd, en weergegeven naast optische signalen met behulp van de software (RedShirt Imaging) (figuur 2). Een oscilloscoop (Tektronix TDS model 1002) wordt ook gebruikt om de oppervlakte ECG s in real-time visualiseren en om adequate pacing te verzekeren. </li><li> ECG-versterker (Hugo Sachs Elektronik) instellingen: High Pass Filter: 0,1 Hz Low Pass Filter: 150 Hz </li><li> De CMOS-camera (RedShirt Imaging) en macroscoop wordt gepositioneerd met behulp van de XYZ-aanpassingen, zodat het oppervlak van het hart is in focus en in het midden van de overname frame. De camera en lenzen zijn gemonteerd op een trillingsisolatie tafel (Minus K Technology) aan resonantiefrequenties te minimaliseren. Op hetzelfde moment, een coaxiale pacing elektrode (Harvard Apparatus) gecontroleerd met een geïsoleerde, S48 elektrische stimulatie-unit (Grass), wordt geplaatst op de rechter atrium en het hart wordt gestimuleerd met 300 slagen per minuut (figuur 1). </li><li> Elektrische stimulatie (Grass) instellingen: Prijs: 5 pulsen per seconde Vertraging: 0,2 ms Duur: 2 ms Volt: 6-12 V Mode: Herhaal Pulse: Single </li><li> Voor optische opnames, die bewegingsartefacten gebrek van samentrekking, het hart moet elektromechanisch worden ontkoppeld. Dit doen we door opnieuw te schakelen perfusie lijnen naar Krebs-Henseleit oplossing die 11 mmol / l BDM bevat. Tussen de overnames, is het hart geperfuseerd met onvervalste Krebs-Henseleit om te helpen levensvatbaarheid van het preparaat te behouden. </li><li> De opname parameters worden ingesteld met behulp van de software (RedShirt Imaging) met de volgende overname instellingen: Configuratie: 2000 Hz; 128x128 pixel array- Frame Interval: 0,5 ms Camera Amplifier Gain: 5x On-Chip Gain: 8x-12Me-well Sluiter: 500 ms vertraging Aantal frames: 4000 Duur: 2000 ms </li><li> Alle kamers en apparatuur verlichting uitgeschakeld of afgeschermd om achtergrondgeluid te elimineren tijdens het opnemen. Het LED-lampje verlicht het hart alleen tijdens de optische opname te verminderen foto-bleken en kleurstof toxiciteit. De lichtbron sluiter wordt bediend met een 5 V-puls geleverd via het bedieningspaneel door middel van een D-to-Een bord in de computer (RedShirt Imaging). </li></ol> Deel 4: Analyseer acquisitie informatie met behulp van RedShirt Imaging Software <ol><li> Na de overname, worden de gegevens verwerkt met behulp van verschillende instellingen van het filter. We maken doorgaans gebruik van de standaardinstellingen, behalve wanneer het aanpassen van de Band Stop / Pass-filter, die is ingesteld met de linker grens op 44,0 en de juiste grens op 98,0. Daarna de opgenomen informatie wordt verwerkt en een film is gegenereerd (RedShirt Imaging). </li><li> Gegevens van een acquisitie komt overeen met de lokale elektrische activering op 16.384 plaatsen op het hart oppervlak over een periode van 2 seconden. De software laat deze lokale signalen direct worden vergeleken met elkaar en met de atriale en ventriculaire elektrografisch opnames. Gegevens worden vervolgens gevisualiseerd door in kaart brengen van de lokale elektrische activering van kleur en weergave van deze informatie als een animatie van de spatiotemporele elektrische activering op de cardiale oppervlak. Voor het maken van zo&#39;n animatie, gebruiken we de software: <ul><li> tijdelijk en / of ruimtelijk de gegevens filteren </li><li> selecteert u een begin-en eindtijd voor de animatie </li><li> kaart optische signalen naar kleur op basis van rust de lichtsterkte van elke pixel </li><li> overlay van de resulterende kleur gegevens met een foto van het hart </li><li> het genereren van de animatie </li></ul></li></ol> Deel 5: Representatieve resultaten Als de doorbloede hart preparaat werd doodstil tijdens de opname, de optische signalen tonen een duidelijke piek voor elke pixel die betrokken zijn bij een verandering van de emissie-intensiteit van de di-8-ANEPPS. De bijbehorende films (figuren 3 en 4) aan te tonen een excitatie golffront verspreiden over het epicardiale oppervlak van het hart als de gelijktijdig verworven elektrografische-opnamen (figuur 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Een foto van een Langendorff-doorbloed hart voorbereiding beeltenis van de posities van de pacing elektrode op de juiste atrium en de ECG afleidingen zoals beschreven in stap 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger van optische signalen en elektrografische opnames van een perfusie Lewis rat hart. Paneel A toont een beeld van de epicardiale oppervlakte wordt gebruikt voor optische beeldvorming. De positie van de pixels geselecteerd om de veranderingen in fluorescentie-emissie in de tijd Panel B aan te tonen zijn aangegeven met gekleurde pijlen. Elektrografische signalen worden getoond in Panel C met de rode lijn die aangeeft atriale activering en de licht blauwe lijn die overeenkomt met de ventriculaire signaal. Alstublieftve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt; klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Children&#39;s Hospital Boston in te stellen.

Wegnemen van het hart van de verdoofde ratten snel moeten worden uitgevoerd om myocardischemie te voorkomen. Als ischemie of onvoldoende coronaire perfusie optreedt, zal het hart waarschijnlijk ontwikkelen aritmieën en kan worden infarct. Daarnaast zullen deze harten tonen onvoldoende fluorescentie-emissie voor informatieve opnames en de daarop volgende analyses. Voor het laden van de kleurstof, myocardcellen moeten adequaat worden geperfuseerd met Krebs-Henseleit oplossing om vast te stellen en onderhouden van een fysi...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Apparatuur</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex-software</td><td>Apparatuur</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUXEON LED-lichtbron 460-490 nm </td><td>Apparatuur</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG-versterker Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïsche spiegel 505 nm</td><td>Apparatuur</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilter 605 nm long-pass</td><td>Apparatuur</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT zijwaarts</td><td>Apparatuur</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Mini-kogelgewrichtshouder</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Kleine stimulatie-elektrodeset</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 trillingsisolerend tafelplatform</td><td>Apparatuur</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Monopolair ECG-elektrode</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Rollerpomp SCI 400</td><td>Apparatuur</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Rollerpomp MasterFlex Easy Load II</td><td>Apparatuur</td><td>Cole-Parmer</td><td>Model 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Marprene-slang #14</td><td>Apparatuur</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex-slangen</td><td>Apparatuur</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 Vierkante Pulsstimulator</td><td>Apparatuur</td><td>Grastechnologieën</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF-transformatie-isolatie-eenheid</td><td>Apparatuur</td><td>Grastechnologieën</td><td>Model SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5 liter watergekoeld reservoir</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2 liter watergekoeld reservoir</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0,5 liter reservoir met watermantel</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0,25 liter reservoir met watermantel</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml verwarmingsspiraal</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Compliancie-belletjesval</td><td>Apparatuur</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Luer-loskoppelbare canule</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>3-weg stopkraan, FLL naar MLT, zonder poortkapjes</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Thermocepelthermometer</td><td>Apparatuur</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine IT-serie flexibele microprobe </td><td>Apparatuur</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscoop Tektronix TDS 1002</td><td>Apparatuur</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butaandionmonoxime </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>Reagens</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Reagens</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

optisch in kaart brengen van langendorff-geperfuseerde rat hearts

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optische kaart brengen van de cardiale oppervlak met voltage-gevoelige fluorescente kleurstoffen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om elektrische excitatie te onderzoeken in experimentele modellen die variëren in schaal van cel culturen om hele organen<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Met behulp van state-of-the-art optische beeldvorming systemen, genereren en verspreiden van actiepotentialen tijdens normale hartritme of het hele initiëren en onderhouden van aritmieën kunnen worden gevisualiseerd vrijwel direct<sup&gt; [1]</sup&gt;. De meest recente in de handel verkrijgbare systemen kunnen informatie geven op zeer hoge resoluties en spatiotemporele waren gebaseerd op custom-built apparatuur in eerste instantie ontwikkeld om de obstakels worden opgelegd door de meer conventionele methoden te overwinnen elektrofysiologische<sup&gt; [1]</sup&gt;. Ontwikkelingen in hoge resolutie en hoge snelheid Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) camera&#39;s en intens-felle, light-emitting diodes (LED&#39;s) als voltage-gevoelige kleurstoffen, optica, en filters zijn begonnen met het elektrisch signaal overname te maken praktisch voor hart-en celbiologen die meer gewend om te werken met microscopen. Hoewel de nieuwste generatie van CMOS-camera&#39;s kunnen verwerven 10.000 frames per seconde op een 16.384 pixel array, afhankelijk van het type van monstervoorbereiding, reeds lang bestaande fluorescentie overname technologieën zoals fotodiode arrays, laser scanning systemen, en gekoelde charged-coupled device (CCD ) camera&#39;s hebben nog een aantal duidelijke voordelen met betrekking tot dynamisch bereik, signaal-ruisverhouding, en quantum efficiency<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. In de huidige studie werden Lewis rattenharten geperfuseerde<em&gt; Ex vivo</em&gt; Met een kristalloïde perfusaat (Krebs-Henseleit-oplossing) bij 37 ° C op een aangepaste Langendorff apparaat. Na een 20 minuten stabilisatieperiode, werden de harten met tussenpozen geperfuseerd met 11 mmol / l 2,3-butaandion monoxime om krimp-geassocieerde bewegingen te elimineren tijdens de afbeelding overname. Voor optische mapping, we geladen harten met de snelle respons potentiometrische probe di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) en in het kort verlicht het preparaat, met 475 ± 15 nm excitatie licht. Tijdens een typische twee seconden periode van verlichting, was&gt; 605 nm uitgestraalde licht van de cardiale voorbereiding afgebeeld met een high-speed CMOS-camera is aangesloten op een horizontale macroscoop. Voor deze demonstratie, harten werden tempo op 300 slagen per minuut met een coaxiale elektrode is aangesloten op een geïsoleerde elektrische stimulatie eenheid. Gelijktijdig bipolaire elektrografische opnames werden verworven en geanalyseerd, samen met de spanning signalen met behulp van gemakkelijk verkrijgbare software. Op deze manier kan actiepotentialen op het oppervlak van Langendorff-geperfuseerde rattenharten worden gevisualiseerd en geregistreerd bij elektrografisch signalen.

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Optische mapping van het hartoppervlak met voltagesensitieve fluorescente kleurstoffen is een belangrijk instrument geworden om elektrische excitatie te onderzoeken in ...

Hoi, ik ben Yon Ziv van het laboratorium van Dr. Cohen van de afdeling Anesthesiologie van het Children's Hospital en de Howard Medical School. Vandaag laten we een procedure zien voor optische mapping in Lal-geperfuseerde rode harten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de verspreiding van elektrische activiteit op het hartoppervlak te bestuderen.Laten we beginnen. Meng op de ochtend van het experiment vier liter Krebs-Hensel-oplossing (light). Verwijder na het mengen van de oplossing de onopgeloste deeltjes met een filter van 200 micron middels vacuümfiltratie.Los eerst 11 millimol BDM op in één liter van de bereide Krebs Henzel lite-oplossing. Meng vervolgens 100 milliliter Krebs Henzel lite met 10 millimolair D eight NFS in DMSO tot een eindconcentratie van vijf Micromolair D eight annex in de oplossing. De glazen reservoirs met watermantel, de borrelsteen en het hier gebruikte glaswerk zijn allemaal van red.Naughty.Overbreng de twee oplossingen naar de reservoirs die vooraf zijn voorverwarmd tot 41 °C. Zuurstofverrijking van de oplossingen gebeurt met 0,2 micron gefilterd gas middels een ondergedompelde beluchtingspomp; pomp de oplossingen vanuit de drie voorraadreservoirs via het aan de wand gemonteerde Langendorf-systeem met peristaltische pompen en siliconen slangen met lage absorptie om het rattenhart te oogsten. Injecteer eerst een Lewis-rat van 200 tot 250 gram intraperitoneaal met ketamine en xylazine om een diepe algemene anesthesie op te wekken, en met heparine om bloedstolling en myocardiale ischemie tijdens de explantatie te voorkomen.Zodra de rat volledig is geanestheseerd en niet meer reageert op een knijpprik in de teen, kan worden overgegaan tot het verwijderen van het hart. Begin de chirurgische ingreep door eerst de voorste borstwand te verwijderen om gemakkelijk toegang te krijgen tot het hart en de grote vaten. Dissekeer vervolgens voorzichtig het omliggende weefsel en open de pericardzak.Nadat de vena cava inferior is geïdentificeerd, wordt dit vat afgebonden met vijf O Proline-hechtingen en wordt het volledige hart-longblok verwijderd. Plaats het weefsel onmiddellijk in ijskoude Krebs-Henzel light-oplossing in een bekerglas van 50 milliliter op ijs; identificeer snel de aorta ascendens en dissecteer deze van het omringende weefsel. Voer een canule van een passende grootte in de aorta in.Zorg ervoor dat de canule niet te ver in de aortawortel wordt ingebracht om onderbreking van de essentiële perfusie van de coronaire arteriën te voorkomen. Zet de canule vast aan de aorta ascendens. Plaats vervolgens het rattenhart op het Ling Endorf-apparaat zonder luchtbellen in de canule te introduceren.Retrograde coronaire vasculaire perfusie is nu ingesteld met de warme, oxygenatieve Krebs-Hensel-oplossing. Verwijder vanuit de drukbehuizing van het Ling Endorf-apparaat nu overtollig weefsel, waaronder de longen, na reiniging; perfuseer het hart gedurende 20 minuten om herstel van de functie mogelijk te maken en stabiliseer het ritme terwijl het hart wordt geperfuseerd. Voer een zeer dunne thermokoppel-temperatuursonde in de linkerventrikelholte in.Hecht de probe op zijn plaats met 5-0 prolenehechtingen en pas de instellingen van de watercirculatiepompen aan om de temperatuur van het hart te handhaven. Minimaliseer bij 37 °C de beweging van het Perfuse eight dat van de apex van het hart druppelt. Door een stukje gaas in het opvangreservoir te plaatsen, is het hart nu klaar om te worden geladen met potentiometrische kleurstof voor het verkrijgen van elektrografische en optische signalen; voeg de potentiometrische kleurstof dye eight NEPs toe aan het hart.Schakel over naar de perfusielijn die Krebs bevat, gemengd met fluorescente kleurstof. Omdat de atria niet voldoende worden geperfuseerd met kleurstof die via de coronaire arteriën wordt toegediend, wordt een canule van 18 gauge in het linker en/of rechter atrium geplaatst. Vervolgens wordt langzaam een extra 50 milliliters kleurstofoplossing in elk van deze kamers toegediend.Plaats tijdens de laadprocedure voorzichtig drie ECG-elektroden op het oppervlak van het hart, aan de zijde die niet is gericht naar de voor mapping gebruikte optiek. De eerste elektrode wordt geplaatst op het posterieure apicale gedeelte van de linker ventrikel.De tweede wordt op het linkeratrium geplaatst en de derde dient als referentie-elektrode op de aortawortel. De atriale en ventriculaire elektrografische signalen worden vervolgens versterkt, gedigitaliseerd en als optische signalen weergegeven met behulp van de software. Een oscilloscoop wordt daarnaast gebruikt om de oppervlakte-ECG's in real-time te visualiseren en om een adequate pacing te garanderen.Stel de ECG-versterker in op 0,1 hertz voor het hoogdoorlaatfilter en 150 hertz voor het laagdoorlaatfilter. Positioneer de CMOS-camera met behulp van de X-, Y- en Z-instellingen. Een stuk glas, dat zich in het brandvlak van de camera bevindt, wordt op het hartoppervlak geplaatst zodat het interessegebied in focus en gecentreerd in het acquisitiekader staat. De camera en de optiek zijn gemonteerd op een trillingsisolatietafel om resonantiefrequenties te minimaliseren.Tegelijkertijd wordt er op het rechteratrium een coaxiale pacing-elektrode geplaatst, aangestuurd door een geïsoleerde S 48 elektrische stimulatie-unit. Hiermee wordt het hart gepaced met 300 slagen per minuut; stel de elektrische stimulatie als volgt in.De frequentie moet vijf pulsen per seconde zijn, met een vertraging van 0,2 milliseconden, een stimulatieduur van twee milliseconden met een sterkte van 6 tot 12 volt en de modus ingesteld op repeat en single pulse. Voor optische opnames zonder bewegingsartefacten door contractie moet het hart elektromechanisch ontkoppeld worden. Doe dit door de perfusielijnen opnieuw om te schakelen naar Krebs-Hensel-oplossing met 11 millimol BDM.Tussen de acquisities door. Perfuseer het hart met onverdunde Krebs HENSEL light om de levensvatbaarheid van het preparaat te behouden. Configureer de parameters van de opnamesoftware naar 2000 hertz met een array van 128 bij 128 pixels.Het frame-interval moet worden ingesteld op 0,5 milliseconden en de gains moeten worden ingesteld op vijf x voor de cameraversterker en acht x voor de on-chip gain. De on-chip gain moet tevens worden ingesteld op 12. Stel de camerabesturing van de software in op een sluitervertraging van 500 milliseconden en neem 4 000 frames op met een duur van 2000 milliseconden.Schakel alle kamer- en apparatuurverlichting uit of scherm deze af om achtergrondruis tijdens de opname te elimineren; het LED-licht verlicht het hart alleen tijdens de optische registratie. Om fotobleking en kleurstoftoxiciteit te verminderen, wordt de sluiter van de lichtbron aangestuurd via een puls van vijf volt, die na acquisitie door het computerprogramma via een D2A-bord naar het bedieningspaneel wordt gestuurd. Verwerk de gegevens met verschillende filterinstellingen.De standaardinstellingen worden doorgaans gebruikt, behalve bij het aanpassen van het band-stop pass-filter, waarbij de linkerboundary op 44,0 en de rechterboundary op 98,0 wordt ingesteld. Vervolgens worden de geregistreerde gegevens verwerkt en gebruikt om een video te genereren. Gegevens van één acquisitie komen overeen met de lokale elektrische activatie op 16.384 locaties op het hartoppervlak over een periode van twee seconden.De software maakt het mogelijk om deze lokale signalen direct met elkaar en met de elektrografische registratiedata van het atrium en het ventrikel te vergelijken door lokale elektrische activatie aan kleuren te koppelen en deze informatie weer te geven als een animatie die de spatiotemporele elektrische activatie op het hartoppervlak toont. Om een dergelijke animatie te maken, gebruikt u eerst de software om de data temporeel en/of ruimtelijk te filteren. Selecteer vervolgens een start- en eindtijd voor de animatie.Ten derde worden de optische signalen gekoppeld aan kleuren op basis van de rustlichtintensiteit van elke pixel. Ten vierde worden de resulterende kleurgegevens over een afbeelding van het hart gelegd, en tot slot wordt de animatie gegenereerd indien de geperfundeerde hartpreparaat bewegingloos was. Tijdens de opname vertonen de optische signalen één duidelijke piek voor elke pixel die betrokken is bij een verandering in de emissie-intensiteit van D eight anep. Deze real-time imaging-films demonstreren een excitatie-golffront dat zich over het epicardiale oppervlak van het hart voortplant, evenals de gelijktijdig verkregen elektrografische opnames.We hebben zojuist een techniek met een hoge resolutie gedemonstreerd om de beweging van actiepotentialen op het oppervlak van een Alanor Perfuse Red Heart optisch in beeld te brengen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het hart snel uit de geanestheseerde red te verwijderen. Om myocardiale ischemie te voorkomen, moeten de myocardcellen adequaat worden geperfuseerd en moet het hart volledig zijn verzadigd met watergevoelige kleurstof.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van de methodologie en de resultaten van gelijktijdige endocardiale en epicardiale optische in kaart brengen van de elektrische prikkeling in de intacte linker atrium van een Langendorff-doorbloed schapen hart tijdens stretch-geïnduceerde atriumfibrilleren.

High-Resolution endocardiale en epicardiale Optical Mapping in een Schaap Model van Stretch-Induced atriale fibrillatie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

In this video, we perform Langendorff retrograde perfusion of an isolated mouse heart. During the procedure, the cardiac activity of the heart is maintained by perfusing it retrogradely with a perfusion solution via the coronary arteries using a cannula inserted into the ascending aorta. The model is used to study the cardiac pathophysiology of the heart.

Langendorff Retrograde Heart Perfusion: An Ex Vivo Technique to Perfuse Isolated Mouse Heart

Het geïsoleerde rattenhart is een duurzaam model voor ischemie-reperfusieletsel. Hier beschrijven we het proces van het oogsten van het kloppende hart van een rat via in situ aortacanuletie, Langendorff-perfusie van het hart, gesimuleerde ischemie-reperfusieletsel en infarctkleuring om de omvang van het ischemische letsel te bevestigen.

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Leer optische mapping van actiepotentialen op het oppervlak van Langendorff-geperfuseerde rattenharten met di-8-ANEPPS. Deze hoge-resolutiemethode maakt gedetailleerde studie van cardiale elektrische activiteit mogelijk.

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Meer video's verkennen