Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Live-cell imaging is bijzonder nuttig bij het bestuderen van de dynamiek van organeltransport. Deze video belicht een procedure die wordt gebruikt om dense core vesicles in gekweekte hippocampale neuronen in beeld te brengen. Transfectiecomplexen worden eerst verkregen door DMEM-medium en het lipectomy-transfectiereagens te mengen.

Aangezien hippocampale neuronen worden gekweekt op omgekeerde dekglasplaatjes tegenover een gliale monolaag, moeten deze dekglasplaatjes worden omgedraaid om ze bloot te stellen aan het transfectiereagens. Nadat er voldoende tijd is gegeven voor de expressie van GFP-getagde dense core viscal proteins, wordt er een beeldkamer geconstrueerd. De beeldvorming van dense core ICALs in gekweekte neuronen kan worden uitgevoerd met behulp van wide-field fluorescentiemicroscopie.

Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast voor het afbeelden van andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen en peroxisomen. Hallo, ik ben Michael Silverman en welkom in mijn laboratorium voor cellulaire neurowetenschappen aan de Simon Fraser University. Wij zijn geïnteresseerd in hoe organellen bewegen in zenuwcellen.

Om deze vraag te beantwoorden, labelen we membraangebonden organellen, specifiek dense core vesicles in gekweekte hippocampale neuronen. En om u te laten zien hoe we dit doen, geef ik het woord aan David. Hallo, ik ben David van het Silverman-lab.

Vandaag laat ik u een procedure zien voor live-cell imaging van dense core vesicles en gekweekte neuronen met behulp van widefield-fluorescentiemicroscopie. Laten we beginnen. Voor de meeste experimenten gebruiken we schaaltjes met rat hippocampaal neuronen die zijn gekweekt bij een celdichtheid van 250.000 cellen per schaaltje van zes centimeter. Label voor elke transfectie twee buisjes van 1,5 milliliter: één voor het plasmide-DNA en de andere voor het transfectiereagens.

Combineer in een laminaire flowkast één µg plasmid DNA met 100 µL MEM in een enkele buis bij kamertemperatuur; zorg ervoor dat de gebruikte MEM geen supplementen bevat. Combineer zes µL lip met 100 µL MEM in de andere buis. Dezelfde hoeveelheid kan worden gebruikt voor dubbele transfectie, hoewel de lip-DNA-verhouding in dergelijke gevallen gehalveerd zal zijn.

Om de houdbaarheid van het lipide-reagens te waarborgen, dient dit te allen tijde gekoeld te worden bewaard of in een koelblok op het werkblad te worden geplaatst; incubeer de buisjes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng het mengsel van DNA in MEM over in de lipide-buis en meng dit voorzichtig met APE; incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 25 minuten 60 µL van 50 mM K-neuronzuur toe om cytotoxische schade aan de gekweekte neuronen te minimaliseren.

Aangezien we neuronen kweken op de onderzijde van dekglasjes die boven een GL-monolaag zijn opgehangen, is het noodzakelijk om de dekglasjes om te keren en de neuronen bloot te stellen aan de transfectie-oplossing. Keer het dekglas voorzichtig om met de zijde waar de neuronen zich bevinden naar boven, met behulp van steriele pincetten. Plaats ze zodanig dat ze elkaar niet overlappen.

Zorg ervoor dat het met neuronen gecoate oppervlak van het dekglas of het met ggl gecoate oppervlak van de schaal niet wordt bekrast. Neem aan het einde van de incubatie van 30 minuten ongeveer 0,5 milliliters medium uit de schaal van zes centimeter en meng dit voorzichtig met het DNA in de buis. Breng de DNA-oplossing terug naar de schaal door deze gelijkmatig op het oppervlak van het medium te druppelen.

Schuif de schaal voorzichtig heen en weer in één richting, maar zorg ervoor dat het medium niet opbolt. Stop na het mengen in één richting en herhaal dit in de loodrechte richting om de DNA-lipectomiecomplexen gelijkmatig over de schaal te verspreiden. Incubeer gedurende 90 minuten in de weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.

Draai na incubatie de dekglasjes om zodat de pootjes naar beneden wijzen en rangschik ze zo dat ze elkaar niet overlappen. Laat tot slot de expressie van het DNA gedurende de gewenste tijd doorgaan, wat doorgaans overnight tot 48 uur in de incubator is. Live imaging van GFP-gelabelde dense core vesicles in gekweekte hippocampale neuronen vereist een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een CCD-camera.

Een beeldkamer met een temperatuurregelaar en een objectiefverwarmer is vereist. De kamer mag geen open poorten bevatten; deze aanpassing kan worden doorgegeven bij het bestellen van de kamer. Start vervolgens de microscoopcamera, de fluorescentielamp en de software voor beeldacquisitie op.

Schakel de stroom naar het platform van de kamer en de objectiefverwarmers in. Dit is ook een geschikt moment om een druppel olie op de objectieven aan te brengen. Bereid nu het verwarmde platform en de beeldvormingskamer voor.

Voor een gemakkelijker beheer. Markeer één zijde van de bovenkant van de kamer met een permanente marker. Plaats de bovenkant van de kamer naar boven op de dop van een 50 milliliter buis, wat een ideale houder voor de kamer is.

Breng een ring vet aan in de groef rondom het gat aan de zijkant van de kamer met het label top. Vermijd overmatig gebruik van het vet, aangezien dit de kamer kan binnendringen en het observeerbare gebied kan verkleinen. Gebruik hiervoor een pincet.

Bevestig een schoon, ongebruikt dekglas van 18 centimeter aan de bovenzijde van de kamer. Oefen lichte druk uit op de randen van het dekglas om een luchtdichte afsluiting te creëren in de verzonken groef van de kamer. Keer de kamer om en breng een vergelijkbare ring vet aan in de groef aan de tegenovergestelde of onderzijde van de kamer.

Breng 750 µL imagingmedium over naar de kamer. Dit is een overmaat, maar het vet moet voorkomen dat het medium overstroomt en het overschot voorkomt dat er luchtbellen ingesloten raken wanneer het dekglas met de cellen wordt geplaatst. Bewaar de voorbereide kamer in de weefselkweekincubator tot gebruik.

Langdurige incubaties van een uur of langer moeten worden vermeden, omdat het beeldvormingsmedium zal verdampen en de samenstelling zal veranderen. Voor de uiteindelijke assemblage van de kamer voor lifestyle-beeldvorming verplaatst u de voorbereide kamer en een schaal met getransfecteerde dekglasjes van de incubator naar de weefselkweekkast. Verwijder met een steriele pincet voorzichtig één dekglasje uit de schaal met getransfecteerde cellen.

Raak vervolgens met de rand van het dekglas een Kimwipe aan om het groeimedium weg te trekken. Plaats daarna het dekglas met de zijde met neuronen naar beneden op de voorbereide kamer. Laat één zijde van het dekglas eerst het vet raken en oefen druk uit langs de randen om het dekglas vlak aan te leggen zonder luchtbellen in te sluiten.

Het is te verwachten dat overtollig beeldimagium uitloopt; veeg dit overschot af, maar let erop dat het dekglas niet verschuift. Verplaats de kamer naar de voorverwarmde platformverwarmer en zet de kamer vast. Verplaats de kamer vervolgens naar de objecttafel om fotobleken en fototoxiciteit te beperken.

Stel de lamp in op de minimale intensiteit die nodig is om de getransfecteerde cellen te vinden. Zoek nu een cel van belang. Bij gebruik van een olie-objectief met een lage vergroting, zoals 40 x, is het raadzaam om een vastgesteld zoekpatroon te volgen om een maximale dekking van het dekglas te garanderen en redundante beeldacquisities te voorkomen.

Zodra een gewenst gezichtsveld is gelokaliseerd, schakelt u over naar het kanaal van het fluorescent gelabelde eiwit van belang. Schakel over naar een olie-objectief met een hoge vergroting, zoals 60 tot 100x, en zet de lampintensiteit terug naar een hoge instelling. Gebruik stream-acquisitie of een vergelijkbare functie van uw imaging-software om de dynamiek van het fluorescent gelabelde eiwit vast te leggen voor snel bewegende organellen. De belichtingstijd en de vertraging tussen belichtingen moeten worden geminimaliseerd om opnames met een hoge framerate te produceren.

Focusdrift die in het schermvoorbeeld wordt waargenomen, kan in realtime worden gecorrigeerd door handmatige focusaanpassing. Zorg ervoor dat u een fasebeeld en alle andere bijbehorende beelden maakt die nodig zijn voor latere analyse en presentatie. Sla alle beelden op voordat u het dekglas verder verkent en de volgende opname maakt.

Gewoonlijk worden drie tot vijf opnames van één dekglas als succesvol beschouwd en worden dekglazen gedurende 30 tot 60 minuten per stuk afgebeeld; fototoxiciteit en de algemene gezondheid van de cel moeten in acht worden genomen, aangezien transporteurs in beschadigde cellen afnemen. Observaties via live-cell imaging bestaan doorgaans uit opnames, ook wel image stacks genoemd, die de beweging van fluorescentie-gelabelde organellen binnen het gezichtsveld tonen. Hier is een representatieve film van transport van dense core iCal.

De kleuren zijn omgekeerd voor een betere observatie. Let op de bewegende deeltjes. CH-grafieken zijn afbeeldingen die de beweging van deeltjes illustreren door linescans naast elkaar te plaatsen, waarbij elk tijdstip wordt weergegeven door een kolom in de grafiek.

Deze figuur laat zien hoe twee deeltjes die in tegenovergestelde richtingen bewegen, worden weergegeven in een CH-grafiek. Verdere analyse van chronografen kan informatie verschaffen over de fluxsnelheid van deeltjes, omkeringen van de looplengte en stationaire deeltjes. Hallo, we hebben zojuist laten zien hoe u hogesnelheidsopnamen maakt van dsco-vesikeltransport en gekweekte hippo-capitale neuronen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle componenten van de beeldvormingskamer en het platform moeten worden voorverwarmd om stress in de cellen te verminderen tijdens hun overgang van de incubator naar de objecttafel. U dient snel maar zorgvuldig te werken. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.