Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Deze procedure begint met het voorbereiden van een drosophila-larve, waarbij de larve binnenstebuiten is gekeerd om het oppervlak van de spiercellen van de lichaamswand, de geassocieerde motorneuronen en de gliale cellen bloot te leggen. Dit gebeurt door fluorescerende kleuring van presynaptische neuronale terminalen te combineren met endogene expressie van GFP en DS red, gericht op gliale en postsynaptische spiercelmembranen, en visualisatie van de parasynaptische ruimte. Met behulp van fluorescerende kleurstoffen kan in een levende preparatie een duidelijk beeld worden verkregen van de structurele veranderingen die optreden bij de gliale neuromusculaire overgang. Hallo, ik ben D Brink in het ALS-lab van Vanessa aan de University of British Columbia, afdeling zoölogie. Vandaag laat ik u een weefselpreparaat en twee celmarkeringsmethoden zien voor het beelden van levend weefsel van al-larven voor confocale microscopie.

We gebruiken deze procedure in het laboratorium om glia-cellen bij de neuromusculaire synaps te bestuderen. Voor iets geheel anders: de inside-out weefselpreparatie begint met het bepalen van het stadium van de larven. Deze procedure wordt gedemonstreerd met dwalende derde-stadium larven omdat ze groot zijn en eenvoudig te dissekeren; gebruik uitsluitend W3-larven die actief kruipen.

Reinig vervolgens het oppervlak van de larven met een zeer zachte penseel in een Petrischaal met dubbel gedestilleerd water. Het reinigen van de larven is belangrijk omdat dit leidt tot een betere optiek en bovendien de bacteriën vermindert. Nadat de larven zijn gereinigd, worden ze overgebracht naar een kleine Petrischaal met drie milliliters ijskoud HL6 met vijf millimolaire glutamaat.

Plaats de schaal op ijs totdat het dier stopt met bewegen en ontspant, wat gewoonlijk ongeveer twee minuten duurt. Zodra de larve is opgehouden met bewegen, kunt u beginnen met de dissectie van het weefsel met behulp van een dissectiemicroscoop, waarbij u de veerschaar in uw dominante hand en de zeer fijne pincet vasthoudt. Maak met de schaar in de andere hand een klein gaatje in de lichaamswand om de druk over de lichaamswand te egaliseren, terwijl u het dier voorzichtig tegen de bodem van de schaal houdt.

Snijd met de pincet de achterste twee segmenten af en ontleed de ingewanden. Er zal waarschijnlijk wat vetlichaam door de incisie uit de lichaamsholte komen. Snijd dit weefsel ook weg.

Houd de larven vervolgens voorzichtig tegen de bodem van de schaal met de fijne pincet. Houd met uw andere hand een stompe insectennaald nummer nul vast en druk deze tegen de monddelen van de larve. Duw de monddelen door de lichaamsholte, alsof u een sok binnenstebuiten keert over uw vuist.

Het binnenstebuiten gekeerde weefsel moet er zo uitzien. Dissecteer met de ultrafijne dissectieschaar het vetlichaam en de tracheën weg van de lichaamswand. Verwijder zoveel mogelijk van het vetlichaam.

Zorg ervoor dat u de tracheeën niet lostrekt of het zenuwstelsel beschadigt. Het openscheuren van de tracheeën zal gaten in de spieren van de lichaamswand veroorzaken. Wanneer de dissectie voltooid is, moeten de spieren doorschijnend en ontspannen zijn, en niet ondoorzichtig of gecontracteerd.

Wanneer u de spier bij kamertemperatuur in HL 6 zonder glutamaat plaatst, zal deze waarschijnlijk ritmisch samentrekken. Omdat de motorische patroongeneratoren in het CZS actief zijn, neigt de intacte binnengesneden lichaamswand ernaar om dubbel te vouwen langs de dorsale en ventrale middellijnen. Hierdoor biedt het preparaat een linker- of rechterhelft van het dier ter visualisatie.

Monteer tot slot het weefsel op een microscoopglaasje met een overbruggingsarrangement van het dekglas. De procedures voor het monteren van het weefsel worden later getoond. Om te beginnen met het labelen van neuronale batons, pipetteer 30 µL fluorescent gelabelde primaire anti-HRP antilichaamoplossing in HL zes en plaats een druppel op een Petrischaal.

Dompel vervolgens de binnenstebuiten gekeerde preparaat van de lichaamswand onder in het kleurbad. Na ongeveer vijf minuten kan de labeling van de neuronale terminals zichtbaar worden, maar incubeer gedurende 10 tot 20 minuten voor een volledige en heldere labeling.

Om het overtollige HRP-label af te spoelen, plaatst u het weefsel gedurende 10 tot 30 seconden in een halve milliliter HL six bij kamertemperatuur. Niet gebonden kleurstof spoelt snel weg, waardoor de spoelcyclus niet lang of intensief hoeft te zijn. Het gelabelde weefsel kan nu worden gemonteerd en gevisualiseerd met behulp van microscopie.

Een variatie op het zojuist getoonde protocol voor levende antilichaamlabeling is het gebruik van een fluorescent geconjugeerd dextrine om vloeistofgevulde extracellulaire ruimtes te markeren. Om deze procedure te starten, verdunt u fluorescent geconjugeerd dextrinestof in HL six tot een concentratie van 0,001 mg/mL. Het kan nodig zijn om de dextrineconcentratie aan te passen als de exacte timing van de diffusie in de extracellulaire ruimte niet kritisch is.

Pipetteer een druppel van 20 µL kleurstof op een gebrugde dekglasplaat en breng de weefselpreparaat over naar het kleuringsbad. Als het inside-out weefsel niet geperfuseerd hoeft te worden of als het volume HL six klein moet blijven, kan het op een dubbel gebrugde objectglasplaat worden gemonteerd. Begin met het vastlijmen van twee vierkante dekglasplaatjes van 18 millimeter met secondelijm op een zeer schone microscoopglasplaat.

Laat een opening van twee millimeter tussen de randen van de dekglasjes en centreer deze opening. Plaats deze ongeveer in het midden van het preparaatglas. Laat de lijm volledig drogen, anders vormt er zich een film over het waterige medium rondom uw weefselpreparaat.

Plaats vervolgens een druppel van 30 µL HL six in de opening tussen de dekglasjes. Positioneer het binneste-buiten gekeerde weefsel in de druppel HL six. Het kan nodig zijn om het weefsel diagonaal te plaatsen als de larve groot is en uw beeldacquisitiesysteem een beperkte pixelmatrix heeft.

Breng een kleine hoeveelheid Vaseline aan op de randen van een derde dekglas van 18 millimeter en plaats deze met de vetzijde naar beneden op de twee gelijmde dekglazen over het weefsel; druk voorzichtig aan. Hier zijn de resultaten van onze twee methoden voor acute fluorescente labeling van de inside-out larvenpreparaat, verkregen met een spinning disc confocale microscoop. De eerste is een optische stack-afbeelding van een gliale zenuw-spiersynaps met levende, anti-HRP gelabelde buton-terminalen.

Aan het oppervlak van de spiercel zien we helder gelabelde neurale boutons-achtige terminalen, in het blauw gepseudokleurd. In het midden van de beeldstapel vinden we GFP-gelabelde gliale extensies in het groen, evenals blauw HRP-gelabelde batons. Rondom de batons zijn dwarsdoorsneden te zien van de zakvormige SSR, de synaptische reticula, die in het midden van de stapel rood gekleurd zijn; dieper in de stapel bevinden zich de DSred-gelabelde SSR.

De SSR's zijn de gespecialiseerde synaptische regio's van de spiercel. De bns nestelen zich in de holtes in de spiercellen, net als sommige delen van de groene gliale extensies. De gliale celextensies intercaleren rond de BNS en SSR, maar bedekken het oppervlak van de synaps niet als een deklaag in de diepste lagen van de stapel.

We zien groene gliale extensies en de rode SSR, maar minder van de butonterminals. We kunnen ook dwarsdoorsneden vinden van de motorische zenuw die de spier innerveert. Gliale cellen omhullen de motorische zenuw, waardoor deze ook groen is.

Het tweede resultaat van de acute fluorescerende markering van de inside-out larvale preparatie is de fluorescent gelabelde dextrine-synaps. Hier is de vloeistof in de parasynaptische ruimte of synaptische spleet rood gemarkeerd. Op de oppervlaktelagen van de optische stack-afbeelding bevindt zich een vloeistoflaag van rode dextrine-kleurstof, en u kunt zien waar deze zich ophoopt in de rimpeldepressies op het plasmamembraan van de spier.

In diepere lagen van de stack is de fluorescerende dextrinekleurstof in de synaptische spleten gesijpeld; er vormen zich kleine donutvormige ringen van kleurstof tussen de neuronterminals en de blauw gelabelde SSR-pockets. Dit is de synaptische spleet, geaccentueerd met kleurstof. De groene gliale lamella blokkeert de penetratie van de kleurstof in de spleet in de diepere lagen van de beeldstack niet.

De meest prominente kenmerken zijn de SSR of synaptische regio van de spier, blauw gelabeld, en de platte gliale uitlopers, die groen zijn. Evenzo is de gliale schede rond de oninnerverende axonen in de diepere lagen groen. De gliale schede lijkt de dextrinekleurstof uit te sluiten.

Ik heb u zojuist een nieuwe manier laten zien om de gliale zenuw-spier-synaps te visualiseren in een inside-out weefselpreparaat van Drosophila-larven. Bij het prepareren van het weefsel is het belangrijk om erop te letten dat het weefsel zeer voorzichtig wordt behandeld, dat de spier ontspannen is en dat de perifere zenuwen niet beschadigd raken. Ik wil graag afsluiten met een citaat van Marx.

De tijd vliegt als een pijl. Angst vliegt als een banaan.