Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Een met sogar gecoat dekglas, gemaakt door een druppel sogar over het glas uit te smeren en dit een nacht te laten uitharden, wordt in de cirkelvormige holte van de prefab registratiekamer geplaatst en bedekt met registratie-oplossing. Een worm die in het midden is geplaatst, wordt vanaf de kop of staart aan het oppervlak van de sill guard gelijmd door met een lijmpipet lijm aan de dorsale zijde van de worm aan te brengen. Zodra het lijmen is voltooid, wordt met een glazen naald een incisie gemaakt naast de vulva op de interface tussen de cuticula en de lijm, die vervolgens richting de kop wordt uitgebreid na extractie van de viscera en eieren uit de lichaamsholte.

De gesneden rand van de incisie wordt met de lijm op de agar vastgelast, waardoor de ventrale zenuw en de spieren van de lichaamswand worden blootgelegd. De ventrale mediale spier anterieur van de vulva wordt via een patchclamp gemeten en de stimulerende elektrode wordt stroomopwaarts op het zenuwstreng geplaatst. Hallo, ik ben Janet Richmond, associate professor aan de afdeling Biological Sciences van de University of Illinois Chicago.

Vandaag laat ik u een dissectietechniek zien waarmee we de neuromusculaire juncties van de zeeslak kunnen blootleggen voor elektrofysiologische registraties. We gebruiken deze preparatie om synaptische transmissie te bestuderen.

Oké, we gaan beginnen. Voordat we met de nematoden gaan werken, moet er ten minste één dag voor de procedure bepaalde hardware worden vervaardigd: een dissectiekamer voor opnamen, met S-guard gecoate glazen dekglasjes, oude pipetten, een lijmapplicator en een extractiepipet.

Begin met het construeren van de kamer. Snijd een plaat plexiglas van 1/16 inch dikt zo dat deze overeenkomt met de microscopietafel. De opnames worden uitgevoerd in het midden van het plexiglas.

Boor een cirkelvormig gat dat groot genoeg is om een cirkelvormig dekglas met een diameter van 22 millimeter te accommoderen. Bevestig een dekglas van 48 bij 60 millimeter aan de onderzijde van de kamer onder het gat door in elke hoek van het dekglas een pellet laagsmeltende paraffine-weefsinbeddingswas te plaatsen. De was wordt snel gesmolten op een warmteplaat, waardoor na afkoeling een dunne laag was tussen het plexiglas en het dekglas overblijft; trim eventueel overtollige was weg met een mesje.

Het dekglas dat in de kamer past, is een S-guard gecoat dekglas van 22 millimeter. Om SARD te laten werken, moet dit vers worden bereid volgens de instructies van de fabrikant. Eenmaal bereid, wordt een kleine druppel SARD op elk dekglas geplaatst en met een mesje uitgesmeerd om een gelijkmatig oppervlak te verkrijgen.

De gecoate dekglasjes worden vervolgens in afgesloten containers geplaatst en een nacht lang in een oven van 65 °C gelegd om te uitharden. Morgen zijn ze klaar voor de dissectie gedurende het protocol. Er zijn silicaatglaspipetten nodig met een buitendiameter van één millimeter, uitgetrokken tot een punt met een weerstand van ongeveer vier megaohm; het is daarom raadzaam om een pot hiermee beschikbaar te houden.

Zie de JoVE-publicatie over het maken van patchpipetten en scherpe elektroden met een programmeerbare polar door Miriam Goodman. Voor de technische details om elektrofysiologie uit te voeren, moet de nematode op zijn plaats worden gelijmd. Hiervoor is een lijmaanapplicator vereist.

De lijmapplicator is simpelweg een plastic buisje van twee millimeter met een binnendiameter van één millimeter. Eén uiteinde van het buisje wordt in de mond gehouden. Dit kan worden voorzien van een mondstuk, terwijl het andere uiteinde van het buisje een pipet van één millimeter bevat die is gevuld met lijm.

Tijdens de dissectie wordt ook een gespecialiseerde extractiepipet gebruikt. Deze is gemaakt van een buisje en een pipet, net als de lijm applicator, behalve dat de pipet iets is afgebroken om ruimte te bieden aan de eieren en ingewanden. Begin met het trekken van een waslijn langs de omtrek van de kamer.

Druk nu een met Sylgard gecoat dekglas met de Sylgard-zijde naar boven aan en plaats dit. De waslijn immobiliseert het dekglas en voorkomt dat de registratie-oplossing tijdens de dissectie en registratie onder het dekglas sijpelt en dit verschuift. De kamer wordt vervolgens gevuld met extracellulaire registratie-oplossing. Raadpleeg de bijbehorende tekst voor de samenstelling zodra de kamer is voorbereid.

Gebruik een nematode-pincet om meerdere nematoden in de oplossing te plaatsen. Met ervaring kunnen de zwemmende nematoden worden vastgelijmd zonder aanvullende procedures om beweging te voorkomen. Vul een lijmcontainer, gemaakt van een PCR-dop die in was of boetseerklei is geplaatst, met een werkvoorraad van de Sano acryllijm om met de lijm te kunnen werken.

Maak de lijmapplicator af door de registratiepipet aan het uiteinde van de lijmapplicator te bevestigen. Vul vervolgens de lijmapplicator door middel van mondzuiging onder de dissectiescoop. Het aanbrengen van de lijm op een nematode is uitdagend en vereist oefening, omdat de lijm polymeriseert bij contact met de extracellulaire registratie-oplossing.

Om dit te voorkomen, moet een constante uitstroom van lijm worden gehandhaafd, anders hardt de lijm uit en raakt de pipet verstopt. Als de pipet verstopt raakt, kan deze soms worden ontstopt door de tip voorzichtig tegen het dekglas te tikken. Oefen in het werken met de lijm.

Wanneer u uw naam met lijm op de sil guard kunt schrijven, bent u waarschijnlijk klaar om de cuticula van een nematode vast te lijmen. Kies eerst een nematode nabij het midden van de kamer waar voldoende ruimte is om te werken. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid lijm aan op ofwel de kop of de staart van de nematode en trek de nematode snel naar beneden op het oppervlak van de sil guard.

Breng vervolgens een streep lijm aan langs de dorsale rand van de cuticula van de nematode. Hierdoor wordt de nematode in een C-positie gedwongen, waarbij de vulva naar binnen is gericht. Eventuele openingen in deze lijmlijn moeten worden opgevuld voor een maximale adhesie van de nematode aan de syl guard.

Dit is een lastig proces en het kan helpen om te oefenen met hypo-motiele mutanten. Zoals bij 31, daar bevindt zich vlak rechts een bolvormig deel. Nu ga ik dit preparaat ronddraaien en vervolgens breng ik de glazen naald naar binnen om de incisie te maken. Schakel over naar een handmatige dissectiepipet om de incisie in de cuticula te maken.

Deze pipet moet scherper zijn dan de pipetten voor het lijmen van opnames en moet een korte, stevige schacht hebben voor gebruik bij de hoogste vergroting. Lijn op de dissectiescoop de pipet parallel uit met de longitudinale as van de nematode en steek de punt nabij de vulva in het grensvlak van de cuticula-lijm. Deze incisie laat de hydrostatische druk van de nematode ontsnappen, waardoor eitjes en darmen door het incisiepunt naar buiten worden geduwd.

Ga verder met het opensnijden van de cuticula in de richting van de kop van de nematode met een snijdende beweging, vergelijkbaar met het openen van een envelop, totdat u de pharynx bereikt. Schakel nu over naar de extractiepipet om de interne organen van de nematode weg te zuigen. Nadat de incisie is vrijgemaakt, behoudt de geopende cuticula haar cilindrische vorm.

Neem vervolgens een schone lijmpipet. Gebruik deze om de cuticula aan de rand van de incisie met puntlassen op het sylgard-oppervlak te bevestigen. Het is belangrijk om in deze fase minimale hoeveelheden lijm te gebruiken om beschadiging of afdekking van de njs te voorkomen.

Het ventrale zenuwstreng en de spieren van de lichaamswand liggen nu bloot, maar het basaalmembraan dat de NMJ bedekt, moet nog worden verwijderd. Om dit te doen, zuigt u de extracellulaire registreersolutie uit de kamer en brengt u een extracellulaire registreersolutie aan met 0,4 mg/mL collagenase. Verwijder na 10 tot 20 seconden de collagenase en was het preparaat meerdere keren met verse registreersolutie.

De nematode is nu klaar voor elektrofysiologische registraties. Positioneer de registratiekamer op de tafel van een rechtopstaande microscoop bij de NMJ-positie met een 10x objectief om de nematode te centreren; schakel vervolgens over naar een 40x waterimmersie-objectief met DIC-optiek en controleer of de lichaamswandspieren en het zenuwkoord intact zijn. Positioneer de nematode horizontaal zodat elektroden vanaf zowel de linker- als de rechterzijde kunnen worden ingebracht.

Normaal gesproken patchen we het ventraal mediale lichaam terwijl de spieren zich binnenin de vulva bevinden, maar spieren aan zowel de dorsale als ventrale zijde van het worm kunnen gemakkelijk worden gepatcht met een paar neuronen die als een halve cirkel tegen de spier aan liggen. Patch nu de spier met standaard patchclamp-technieken om een gigaseal te verkrijgen. Uit onze ervaring werken registratie-elektroden met een weerstand van ongeveer vier megaohm goed voor de whole-cell voltage clamp registratiemodus.

Pas meer zuiging toe en stimuleer het membraan tot de gigoseal is doorgebroken. We hebben het over een weerstand van vier megaohm. Als u daar kijkt, ja, daar staat 4,9 megaohm.

Het is groter, normaal. Het ligt in de buurt van wat we gebruiken. Oké. Ja. Nu gaan we proberen om groot uit te pakken op, dus wat dan?

Wat? We willen dat het helemaal naar beneden komt. Ja. Begrepen. Yay.

Bij een goede opname hebben de lichaamswandspieren van volwassen nematoden van het wildtype doorgaans een celmembraancapaciteit van ongeveer 70 picofarad en kunnen ze gedurende ten minste 10 minuten stabiel worden geregistreerd bij een holdingpotentiaal van negatief 60 millivolt met minimale holdingstromen van ongeveer 50 pico amp. Zodra een spiercel is gepatched, zullen stimulatie via een tweede elektrode, een lichtgeactiveerd kanaal, Rodin of de toevoeging van een hyperosmotische oplossing meetbare responsen opwekken. Om een elektrisch opgewekte respons uit te lokken, plaatsen we doorgaans een stimulerende elektrode met extracellulaire oplossing op het ventrale zenuwsnoer, intern ten opzichte van de gepatchte spier.

Deze loose patch-configuratie vereist pulsen van één tot twee milliseconden met een stroomspanning tussen 10 en 40 volt. Helaas raakt het zenuwsnoer na enkele opgewekte responsen onherstelbaar beschadigd en kunnen, om onbekende redenen, met deze configuratie alleen cholinerge opgewekte responsen worden uitgelokt. Alternatief kunnen nematoden die een lichtgeactiveerd kanaal via een dosin-transgeen in verschillende neuronale populaties tot expressie brengen, worden gebruikt om afgifte op te wekken.

Ter voorbereiding op deze methode dient men er rekening mee te houden dat de nematoden die voor deze toepassing worden gebruikt, gekweekt moeten worden op bacteriën die zijn verrijkt met retinol. Bij deze voorbereiding wordt een krachtige 470 nanometer LED, gefilterd door een GFP-excitatiefilter van 450 tot 490 nanometers, gebruikt om de channel-opsine herhaaldelijk te activeren, wat leidt tot de opgewekte afgifte van verschillende neurotransmitters, afhankelijk van welke celtypen de channel tot expressie brengen. De laatste techniek die wordt besproken, kan worden gebruikt om de omvang van de direct vrijzetbare pool (readily releasable pool) van synaptische blaasjes van meerdere neuronen op de geregistreerde spier te meten.

Dit wordt bereikt door een hyperosmotische extracellulaire oplossing gedurende één tot drie seconden met drukpulsen op de gepatchte spier aan te brengen. Het resultaat is een reeks asynchrone postsynaptische gebeurtenissen. Whole-cell voltage-clamp opnames van de lichaamswandspier worden getoond voor elk van de drie hierboven beschreven stimuleringsprotocollen: elektrisch opgewekte, door licht opgewekte en hyperosmotische responsen.

In alle gevallen wordt de ventromediale lichaamswandspier geklemd op negatief 60 millivolt. Wildtype spiercellen vertonen doorgaans hoge frequenties van endogene inward miniature synaptische stromen. In onze standaardregistratie-oplossingen veroorzaakt een depolarisatie van twee milliseconden van het anterieure ventrale zenuwstreng een synchrone afgifte vanuit meerdere synapsen, wat resulteert in een grote opgewekte respons van ongeveer twee tot 2,5 nano ampère.

Bij wild-type wormen tonen de representatieve sporen rechts van de wild-type sporen in A en B de synaptische afgifte in een ernstig ongecoördineerde mutant op 18; paneel C toont een lichtgeëvoceerde respons van de neuromusculaire junctie van een wild-type worm die channel red dosin tot expressie brengt. In cholinerge neuronen produceert een lichtpuls van twee milliseconden doorgaans een respons van 1,5 tot 1,8 nA. Drukejectie van 850 mOsm hyperosmolair zoutoplossing op de spier gedurende één seconde produceert een asynchrone barrage van miniature synaptische stromen, die de readily releasable pool van blaasjes vertegenwoordigen.

Ik heb u zojuist de dissectietechniek getoond die wij gebruiken om de neuromusculaire juncties van de zeepok bloot te leggen en elektrofysiologische registraties uit te voeren. Het is belangrijk om te onthouden dat deze techniek uitdagend is en dat het waarschijnlijk maanden zal duren voordat u deze beheerst. Zodra u de techniek echter onder de knie heeft, is het als fietsen.

De technieken zullen in uw geheugen gegrift blijven, en hoe vaker u ze toepast, hoe sneller en betrouwbaarder de preparatie zal verlopen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.