Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Nou, wat echt uniek is aan de Teer-test is dat het je toestaat om direct antigeenspecifieke T-cellen te visualiseren. De te, de teer is het belangrijkste unieke aspect van onze test. Dat gaat gepaard met een versterkingsstap die we doen.

Je weet dat we de T-cellen isoleren en ze vervolgens laten groeien in een omgeving die het monster verrijkt voor de T-cellen waarin we geïnteresseerd zijn. Dan zijn we in staat om specifiek alleen die cellen te labelen en ze te visualiseren op een flowcytometer. En dus met eerdere tests, dingen zoals CSFE of proliferatietests die al tientallen jaren bestaan, is wat je krijgt gewoon een soort algemene bulkmeting van wat er gebeurt met de hele T-celpopulatie.

Maar je hebt miljoenen T-cellen in het lichaam en ze zien een hele diverse set patronen. Als je geluk hebt, is misschien een op de twee tot 300.000 cellen van de cellen in het monster degene waarnaar je kijkt. En daarom doet deze test die verrijkingstappen.

En dan met een testnummer, en omdat je direct kleurt, kun je eigenlijk een populatie visualiseren die minder dan 1%is van het totale aantal cellen, weg van de achtergrond. En dus kun je zeer kleine verschillen zien en kun je een redelijk nauwkeurig aantal tellen van de T-cellen die in dat bloedmonster zijn, die in die persoon zijn die je patroon van interesse herkent. Maar daar houdt het niet op, want de teters laten je ook toe om niet alleen die T-cellen te labelen, maar ze te isoleren voor verdere analyse.

En de teters die je gebruikt, worden eigenlijk hier gemaakt bij BRI, is dat correct? Ja. We zijn een van een heel klein aantal laboratoria in het land die succesvol klasse twee teters hebben gemaakt. Ons doel is om deze reagentia tegen kosten te distribueren aan alle laboratoria die geïnteresseerd zijn in het importeren van deze technologie.

Wat zou je zeggen zijn de moeilijkste of meest uitdagende aspecten van deze test als het gaat om het repliceren ervan in andere laboratoria? Nou, als ik erover nadenk, zijn er echt twee, de groei van de T-cellen. Het is iets dat echt een beetje een kunst is.

Je hebt bijna dagelijks beslissingen over of de cellen extra voeding nodig hebben of extra ruimte om te groeien. En het tweede deel waarvan ik denk dat het waarschijnlijk het moeilijkst is voor een onervaren operator, is eigenlijk de gegevensanalyse. Soort van uitzoeken welke deel van het signaal echt een positieve reactie is versus welk deel inherent is aan, nou, de natuurkunde en aantrekkingskracht.

En het feit dat alles een zekere mate van plakkerigheid heeft, is iets dat opnieuw veel ervaring vereist, vooral in een context waar de algehele respons een beetje zwak zal zijn. Hoe kan de informatie die je met deze test genereert, patiënten ten goede komen op dit punt? Een van de eerste kenmerken die opduikt bij elke auto-immuunpatiënt is een soort van constellatie van antilichamen die specifiek zijn voor die ziekte.

We weten uit de fundamentele grondbeginselen van de immunologie dat waar er een antilichaamrespons is, er altijd eerst een T-celrespons is. En als we zouden kunnen kijken naar risicopersonen en die sprong in T-celactiviteit zien die de antilichaamvorming zou voorafgaan, zou dat ons dan helpen om echt een nieuw niveau van risico te definiëren of personen op weg zijn naar auto-antilichamen, wat dan hopelijk een venster zou openen voor interventieve therapieën. Deze procedure zal antigeenspecifieke CD vier positieve T-cellen zuiveren en uitbreiden en ze visualiseren met behulp van teters reagentia en apparatuur klasse twee laminaire stroming bioveiligheidskasten.

Dit zal de primaire werkruimte zijn voor de procedure. 50 milliliter kegelbuisjes primaire buis voor PBMC-isolatie een XPBS. Dit moet calcium- en magnesiumvrij zijn fol pack plus folie om te beschermen tegen licht drummed pipette aid CoStar 10 mil pijpjes aërosolbusjes met 50 mil inserts gebruikt om bloedverontreiniging van de centrifuge te voorkomen.

GS zes R centrifuge transfer pijpjes, Pasteur pijpjes hemolytisch buffer met 8,3 gram per liter. Ammoniumchloride 1,0 gram per liter. Natriumbicarbonaat 0,04 gram per liter DI natrium EDTA trian blauw 0,2%oplossing in PBS hemo CYTOMETER 15 milliliter kegelbuisje loopbuffer die bestaat uit PBS aangevuld met twee millimolair EDTA plus vijf gram per liter. BSA max CD vier isolatiekit twee gekocht bij Milin biotech EP magneetblok gekocht bij stem cell technologieën. Andere magnetische celverrijkingsplatforms zouden met gelijke efficiëntie kunnen worden gebruikt. Vijf milliliter polypropyleen buis RPMI 1640 aangevuld met 25 millimolair hippies gebruikt om T-celmedium te maken, gepoold humaan serum gebruikt om T-celmedium aan te vullen pen strip gebruikt om T-celmedium aan te vullen 500 milliliter 0,22 micron fles topfilter steriele 48 welplaat gebruikt voor in vitro expansiecultuur, stap 37 graden CO2 incubator, 20 milligram per milliliter oplossing van synthetisch peptide met de epitoop van belang.

Vijf milliliter polystyreen faxbuisje peptide geladen klasse twee teer gebruikt om antigeenspecifieke T-cellen te visualiseren, anti CD drie, anti CD vier en anti CD 25 antilichamen gebruikt voor het coaten van antigeenspecifieke T-cellen. Fax caliber flow cytometer of equivalent voordat je aan de procedure begint. Verzamel alle materialen en apparatuur in je werkruimte.

De volgende demonstratie zal de volgende stappen omvatten. PBMC-isolatie, CD vier positieve T-celscheiding in vitro expansiecultuur, visualisering van T-cellen door teem of kleuring. Stap een PBMC-isolatie.

Verkrijg een bloedmonster. Bloed moet worden verzameld in spuiten of bloedbuisjes en geanticoaguleerd met heparine in een verhouding van een op 50 om stollen te voorkomen, verwacht een opbrengst van ongeveer 1 miljoen PBMC per milliliter bloed. Ongeveer 40% daarvan zal CD vier positieve T-cellen zijn.

Doel het bloed in 50 milliliter kegelbuisjes. 25 milliliter bloed per buisje. Meng het bloed voorzichtig voordat het ALI stollingsproces begint om het plasma te verdelen.

Voeg PBS toe en breng het totale volume naar 40 milliliter en onderlaag door 11 milliliter fial in de bloedbuis te plaatsen en voorzichtig de pijpjeshouder