Name: Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Leer antigeen-specifieke CD4+ T-cellen visualiseren met MHC klasse II tetrameren voor immunologisch onderzoek. Deze methode maakt directe detectie van specifieke T-celresponsen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dick Foley en Leigh Kimball voor hun belangrijke rollen in film en video productie.

1. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isolatie <ol><li> Verkrijgen van een bloedmonster - bloed moet worden verzameld in spuiten of bloed buizen en anti-gecoaguleerd met heparine (01:50 ratio) om te voorkomen dat stolling. Verwacht een opbrengst van ongeveer 1 × 10 6 PBMC per ml bloed - ongeveer 40% van die zal worden CD4 positieve (CD4 +) T-cellen. </li><li> Aliquot het bloed in 50 ml conische buizen, 25 ml per buis. Als het bloed is gescheiden, meng voordat aliquoting om het plasma te verdelen </li><li> Voeg PBS, waardoor het totale volume tot 40 ml en onderlaag door het opstellen van 11 ml Ficoll, het invoegen in bloed tube, en zorgvuldig verwijderen van de pipet Hulp van de pipet. De Ficoll zal langzaam af in de bodem van de buis. Zodra het niveau heeft vereffend is, verwijder dan eerst langzaam de pipet uit het bloed buis en gooi deze weg. </li><li> Cap het bloed buizen en te verplaatsen naar de Aerosolve canisters. Sluit het canisters en centrifugeer op 900 xg gedurende 20 minuten - geen rem. Het is cruciaal dat er geen rem wordt toegepast aan het einde van deze spin als de remkracht zal de laag van cellen verstoren. </li><li> Na de spin, moet de PBMC&#39;s vormen een duidelijke witte laag tussen de gele plasma (boven) en transparante Ficoll (onder). Voorzichtig afgeroomd witte bloedcellen laag met behulp van een pipet overdracht en transfer naar nieuwe buis. Sommige plasma en Ficoll kan worden opgesteld met de PBMC&#39;s, maar vermijd het opstellen van een van de rode bloedcellen laag. Gewoonlijk worden twee buisjes bloed kunnen worden gecombineerd in een cel buis bij deze stap om de korrelgrootte te verhogen. </li><li> Voeg PBS, waardoor het totale volume op 50 ml en centrifugeer bij 500 xg gedurende 15 minuten - lage rem in aerosolve canisters. </li><li> Aspireren vloeistof met behulp van een Pasteur pipet, zorg ervoor dat u de pellet te verstoren </li><li> Behandelen met hemolytische buffer door het toevoegen van 5-6 mL aan elke buis en voorzichtig mengen tot klonten te verwijderen. Incubeer voor niet meer dan 5 minuten. </li><li> Voeg PBS, waardoor het totale volume op 50 ml en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten - lage rem. Aerosolve bussen zijn niet langer nodig zijn voor deze langzamer draaien. </li><li> Was twee keer: Zuig vloeistof met behulp van een Pasteur pipet, vul buis met PBS en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Voorafgaand aan de laatste wasstap, verwijder dan een portie van re-geschorste cellen, verdunnen met trypan blauw, en tellen met behulp van een hemocytometer. Deze cellen zullen bepalend zijn voor de reagens volumes gebruikt in de T-cel scheiding stap. </li></ol> 2. CD4 + T-cel-scheiding * <ol><li> Aspireren vloeistof en voeg draaien buffer om het totale volume te brengen tot 40 uL per 10 miljoen cellen. Meestal is dit vereist 30 uL van de buffer plus de resterende pellet volume. </li><li> Overdragen dit volume tot een 15 ml conische buis. </li><li> Voeg antilichaam cocktail van de CD4-isolatie kit - 10 uL per 10 miljoen cellen, cap tube, en plaats op ijs gedurende 10 minuten </li><li> Verwijder de slang van ijs, verwijder dop, en voeg 30 uL van het runnen van buffer per 10 miljoen cellen </li><li> Voeg magnetische korrels van de CD4-isolatie kit - 20 uL per 10 miljoen cellen, cap tube, en plaats op ijs gedurende 15 minuten </li><li> Voeg tien volumes lopen buffer te wassen en bij 230 xg gecentrifugeerd gedurende 10 minuten. </li><li> Tijdens de spin, het opzetten van de magneet en 5 ml polypropyleen buis in uw werkruimte </li><li> Aspireren vloeistof uit celpellet, voeg 2 ml buffer draaien en verwijder de groepjes met behulp van een transferpipet </li><li> Met dezelfde overdracht pipet cellen in de 5 mL buis en broeden in de magneet gedurende 15 minuten </li><li> Voorzichtig decanteren van de CD4 + cellen fractie in een duidelijke 15 ml buis door het omkeren van de magneet en het legen van alle, maar de laatste druppel </li><li> Voeg nog een 2 mL van de exploitatie van buffer om de 5 mL buis en te verwijderen uit magneet </li><li> Voorzichtig spoelen van de CD4-cellen uit de zijkanten van de buis en over te dragen aan een duidelijke 15 ml tube </li><li> Voeg 2 mL T-cel-medium aan elke buis, verwijder porties voor celtelling en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Verdunnen cel monsters met trypan blauw en tellen met behulp van een hemocytometer. Deze cellen zal bepalen van het aantal putten wordt gebruikt voor de uitbreiding cultuur stap. </li></ol> * Als alternatief kan MACS kolommen en kralen (Miltenyi Biotec), de AutoMACS cel afscheider (Miltenyi Biotec), of Robosep cel afscheider (Stem Cell Technologies) worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant in plaats van stappen 2,2 tot 2,11. 3. In vitro Uitbreiding cultuur <ol><li> Aspireren vloeistof uit de CD4 + en CD4-cel-pellets en op basis van de cel telt, voegt cultuur media (meestal 3 miljoen CD4 + cellen per ml en 10 miljoen CD4-cellen per ml werkt goed voor het opzetten van de cultuur). De uitbreiding cultuur vereist 3-5 miljoen CD4-cellen per well en 2-3 miljoen CD4 +-cellen per putje in een totaal volume van 1 ml cultuur media in een 48 goed cultuur plaat. Typisch, CD4 +-cellen zijn de beperkende bevolking </li><li> Indien gewenst, bestralen van de CD4-cellen (5000 Rad<html> s). Aliquot CD4-cellen in het juiste aantal putten op een 48 wells plaat door het toevoegen van 300 tot 500 pi aan elk. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur. Van het aanhangend CD4-cellen zal dienen als antigeen presenterende cellen in de uitbreiding cultuur. </li><li> Haal de plaat uit de incubator. </li><li> Was de putjes door de toevoeging van 500 ul van vers medium en zacht en neer te pipetteren 12-20 keer met een transfer pipet en het verwijderen van alle van de vloeistof. Dit wassen laat achter een laag van het aanklevende antigeen presenterende cellen. </li><li> Wanneer het wassen is voltooid, voeg net genoeg media om de bodem van elk putje (ongeveer 100 uL) natte - zoniet worden de hechtende cellen zal uitdrogen </li><li> Voeg 2-3 miljoen CD4 +-cellen aan elke well. Voeg indien nodig extra media om het totale volume in elk putje tot 1 ml te brengen. </li><li> Voeg de gewenste peptide in elk putje. De typische concentratie voor stimulatie is 10 ug / mL definitief. </li><li> Laat de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 7 dagen. </li><li> Na 7 dagen, voeg 50 uL van Hemogen IL-2 (of equivalent, zoals recombinant IL-2, 10 IU / ml) aan elk putje. </li><li> Op elke volgende dag, monitor celgroei met behulp van een microscoop. Feed putten die nog niet samenvloeiend door het verwijderen van de helft van de media, het toevoegen van verse media en 50 uL van IL-2. Split confluerende putten door resuspenderen van de cellen, het verplaatsen de helft van de cellen naar een lege goed, het toevoegen van vers medium en 50 uL van IL-2. Keer terug cellen incubator. </li><li> De groeiende cellen zullen klaar zijn voor tetrameer na 13-15 Dagen van cultuur. </li></ol> 4. Visualiseren van T-cellen door tetrameer kleuren <ol><li> Aankoop of monteren tetrameren om de peptide / MHC combinaties die de gestimuleerde CD4 + T-cellen (zie bespreking naar bronnen van tetrameer reagentia) te laten matchen. Tetrameren moet ~ 0,5 mg / ml oplossing zijn. </li><li> Verwijder de plaat uit broedmachine </li><li> Voorzichtig te trekken uit de helft van de media uit elk putje </li><li> Overdracht een aliquot van cellen uit elk putje - meestal 75 pl of ongeveer 50.000 cellen - in een 5 mL polystyreen FACS buis </li><li> Voeg tetrameer - typisch een pl per 50 microliter totaal volume - en plaats het in 37 ° C incubator gedurende 1-2 uur. Het is ook raadzaam om een ​​tweede volume van cellen vlek uit elk putje met een verkeerde tetrameer als een negatieve controle. </li><li> Label cellen met anti-CD3, anti-CD4, en anti-CD25 antilichamen door het toevoegen van 3-10 pi van elk antilichaam. Aanvullende of alternatieve antilichaam markers kunnen worden gebruikt. Echter geen gebruik maken van PE-gelabelde antilichamen, omdat dit kanaal moet worden gereserveerd voor de tetrameren. Op dit moment, ook label een kleur of een isotype controle met behulp van extra cellen. </li><li> Incubeer antilichaam gelabelde cellen gedurende 15-30 minuten op ijs of bij 4 ° C. </li><li> Was elke buis met 0,5 tot 2 ml buffer draaien en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Zorgvuldig giet vloeistof uit FACS buizen. Bewaar alle buizen in een afgedekte container (bij voorkeur op ijs) voor daaropvolgende FACS-analyse. </li></ol> 5. Flowcytometer verwerving en analyse <ol><li> Kalibreer de flowcytometer met behulp van referentie-kralen. </li><li> Controleer instrument instellingen: <ol><li> Met behulp van ongekleurde cellen of isotype controles, past u de locatie van de levensvatbare lymfocyt gate (FSC vs SSC). De auto-fluorescentie van alle kanalen door het centreren van de bevolking (door het veranderen van de winst-instellingen) onder het eerste decennium op elke as. </li><li> Met behulp van een kleur-controle-buizen, centrale gebeurtenissen in de juiste kwadranten voor elke afzonderlijke kleur (door het veranderen van de compensatie-instellingen). </li><li> Doe een fijnafstelling van het instrument instellingen met een buis gekleurd met een irrelevante tetrameer. In het bijzonder de instellingen voor de PE-kanaal kan het nodig zijn aangepast omdat tetrameren vaak vlek helderder dan het antilichaam te controleren. De irrelevante tetrameer moet vlek &lt;0,5% van de CD4 + cellen. </li></ol></li><li> Verkrijgen van gegevens voor elke buis <ol><li> Verzamel gebeurtenissen voor elk monster buis en negatieve controle buis </li><li> Verwerven en op te slaan ten minste 20.000 evenementen voor Analysys </li></ol></li><li> Analyseren van gegevens <ol><li> Gegevens importeren bestanden in FACS-analyse software (bijv. CellQuest software, WinMDI of FlowJo). Start uw analyse met behulp van een buis gekleurd met een irrelevant tetrameer. </li><li> Plot FSC vs SSC en trek een hek rondom het live-lymfocyten (figuur 1, links boven paneel). </li><li> Plot CD4 vs CD3 (gated om te leven lymfocyten alleen laten zien) en poorten te tekenen rond de CD3 + en CD4 + populaties (figuur 1 rechts boven paneel). </li><li> Plot CD4 vs tetrameer (gated zodat alleen CD3 + lymfocyten) en stel het kwadrant grenzen, zodat de CD4 + + tetrameer bevolking is minder dan 0,5% (zie figuur 1 linksonder paneel). </li><li> Plot CD25 vs tetrameer (gated aan CD4 +-lymfocyten alleen show) en het kwadrant grenzen te stellen, zodat de CD25 + + tetrameer bevolking is minder dan 0,5% (zie figuur 1 rechtsonder paneel). </li><li> Analyseer alle monsterbuizen zonder de poorten. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png &quot;alt =&quot; Afbeelding 1 &quot;width =&quot; 600 &quot;height =&quot; 342 &quot;/&gt; Figuur 1. Vertegenwoordiger negatieve controle tetrameer kleuringen. Het bovenste linker paneel toont voorwaartse verstrooiing verzen zijwaartse verstrooiing en de lymfocyten grootte poort (R1). Het bovenste rechter paneel is gated voor R1 en toont anti-CD4 versus anti-CD3 en de CD3 + (R2) en CD4 + (R3) poorten. De linker paneel is gated voor R2 en toont anti-CD4 versus tetrameer. De lagere rechter paneel is gated voor R3 en toont anti-CD25 versus tetrameer. De kwadranten voor beide tetrameer percelen werden ingesteld op 0,5%. 6. Representatieve resultaten <ol><li> De tetrameer positieve cellen moet een duidelijke bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen (figuur 2). </li><li> Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog. </li><li> In sommige gevallen kan een MHC / peptide combinatie geven achtergrondkleuring (vaak veroorzaakt door een peptide met een slechte oplosbaarheid). Dergelijke achtergrondkleuring kan worden onderscheiden van een echt positief, want de &quot;valse positieve&quot; cellen zijn niet een afzonderlijke populatie op zowel de CD4-versus tetrameer of de CD25 vs tetrameer plots (figuur 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger positieve tetrameer kleuringen. Het paneel lay-out en gating strategie zijn identiek aan figuur 1. De tetrameer positieve cellen worden weergegeven als een aparte CD4 hoge bevolkingsdichtheid op de anti-CD4 versus tetrameer paneel en een duidelijke CD25 + populatie op de anti-CD25 versus tetrameer paneel. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figuur 3" width="600" height="336" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger van &quot;valse positieve&quot; tetrameer kleuringen. Het paneel lay-out en gating strategie zijn identiek aan figuur 1. De anti-CD4 versus tetrameer paneel toont een onduidelijke &#39;ingeterpte &quot;vlekken. De anti-CD25 versus tetrameer toont ook een &quot;ingeterpte&quot; kleuring, met geen duidelijke trend in de richting van zijn CD25 +.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Begrijpen van de rol van CD4 + T-cellen in de immuniteit is van fundamenteel belang. Echter, antigeen specifieke CD4 + T-cellen zijn moeilijk te detecteren en het gebruik van traditionele methoden te isoleren. In tegenstelling, MHC klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van de CD4 + T-cellen met de gewenste antigen specificiteit. Deze video toont de isolatie, zuivering, en in-vitro-amplificatie van CD4 + T-cellen en de daaropvolgende visualisatie met behulp van tetrameren. Klasse II tetrameren zijn fluorescere...

<table><tbody><tr><td>Biosafety cabinet voor laminaire luchtstroom klasse 2</td><td>apparatuur</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Conische buis van 50 mL</td><td>apparatuur</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>1X PBS (Ca/Mg-vrij)</td><td>reagens</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>in folie gewikkeld ter bescherming tegen licht</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>apparatuur</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Pipet van 10 mL</td><td>apparatuur</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Aerosolve-canisters</td><td>apparatuur</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>met inzetten van 50 mL</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>apparatuur</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>apparatuur</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Pasteur-pipetten</td><td>apparatuur</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Hemolytische buffer</td><td>reagens</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L dinatrium-EDTA</td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,2% in PBS</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>apparatuur</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Conische buis van 15 mL</td><td>apparatuur</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Running buffer</td><td>reagens</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>MACS CD4+ T-cel isolatiekit II</td><td>reagens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>EasySep&amp;#174; magneet</td><td>apparatuur</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buis van 5 mL</td><td>apparatuur</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>reagens</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>met 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Gepoold menselijk serum</td><td>reagens</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>afgenomen van gezonde donoren, hitte-geïnactiveerd en gefilterd</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>reagens</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Flessentopfilter van 500mL 0,22 micron</td><td>apparatuur</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Plaat met 48 wells</td><td>apparatuur</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>apparatuur</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>20 mg/mL synthetisch peptide</td><td>reagens</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Maatsynthese van elke peptideleverancier</td></tr><tr><td>FACS-buis van 5 mL</td><td>apparatuur</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Polystyreen</td></tr><tr><td>Peptide-geladen klasse II tetrameer (zoals beschreven)</td><td>reagens</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voorbereid door de BRI tetrameer core</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>reagens</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>reagens</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>Of equivalent</td></tr><tr><td>Facs Calibur flowcytometer</td><td>apparatuur</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Of equivalent</td></tr></tbody></table>

visualiseren van antigeen specifieke cd4 + t-cellen met behulp van mhc klasse ii tetrameren

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen door flowcytometrie. Deze methode is gebaseerd op de zeer specifieke interactie tussen peptide geladen MHC en de bijbehorende T-cel-receptor. Terwijl de affiniteit van een MHC / peptide molecuul is laag, cross-linking MHC / peptide complexen met streptavidine verhoogt de aviditeit van de interactie, waardoor het gebruik ervan als kleurstoffen. Vanwege de relatief lage frequenties van de CD4 + T-cellen (~ 1 op 300.000 voor een enkele specificiteit) deze test maakt gebruik van een in vitro amplificatie stap te verhogen de drempel van de detectie. Mononucleaire cellen worden gezuiverd uit perifeer bloed door Ficoll onderlaag. CD4 + cellen worden dan van elkaar gescheiden door negatieve selectie met behulp van gebiotinyleerd antilichaam cocktail en anti-biotine gelabeld magnetische korrels. Met behulp van hechtende cellen van de CD4-cel-fractie als antigeen presenterende cellen, CD4 + T-cellen zijn uitgebreid in de media door het toevoegen van een antigene peptiden-en IL-2. De uitgebreide cellen zijn gekleurd met de bijbehorende klasse II tetrameer door incubatie bij 37 C gedurende een uur en daarna gekleurd met oppervlakte-antilichamen zoals anti-CD4, anti-CD3 en anti-CD25. Na de etikettering, kunnen de cellen direct worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. De tetrameer positieve cellen vormen meestal een aparte bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen. Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog. Omdat het niveau van achtergrond tetrameer vlekken kan variëren, moet positieve kleuring resultaten altijd worden vergeleken met de kleuring van dezelfde cellen met een irrelevante tetrameer. Meerdere variaties van deze fundamentele test zijn mogelijk. Tetrameer positieve cellen kunnen worden gesorteerd voor verdere fenotypische analyse, opname in ELISPOT of proliferatie assays, of andere secundaire testen. Verschillende groepen hebben ook aangetoond dat co-kleuring met behulp van tetrameren en ofwel anti-cytokine of anti-Foxp3 antilichamen.

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Tetrameren van het hoofdhistocompatibiliteitscomplex (MHC) klasse II maken de directe visualisatie van antigeenspecifieke CD4+ T-cellen mogelijk via flowcytometrie. Deze methode ...

Wat de Teer-assay echt uniek maakt, is dat hiermee antigeenspecifieke T-cellen direct gevisualiseerd kunnen worden. De Teer is het belangrijkste unieke aspect van onze assay. Dit is gekoppeld aan een amplificatiestap die wij uitvoeren.We isoleren de T-cellen en kweken deze vervolgens in een omgeving die het monster verrijkt met de T-cellen waarin we geïnteresseerd zijn. Hierdoor zijn we in staat om specifiek alleen die cellen te labelen en ze te visualiseren met een flowcytometer. Bij eerdere assays, zoals CFSE of proliferatie-assays die al decennia worden gebruikt, verkrijg je slechts een globale bulkmeting van wat er gebeurt met de gehele T-celpopulatie.Maar er zijn miljoenen T-cellen in het lichaam en zij zien een hele diverse set patronen. Met een beetje geluk is misschien één op de 200.000 tot 300.000 cellen in het monster degene waarnaar u op zoek bent. En dat is waarom deze assay deze verrijkingsstappen bevat.En vervolgens, met een testnummer, en omdat u direct kleurt, kunt u daadwerkelijk een populatie visualiseren die minder dan 1% van het totaal aantal cellen beslaat, gescheiden van de achtergrond. Hierdoor kunt u zeer kleine verschillen waarnemen en een vrij nauwkeurige

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

This video demonstrates a method for characterizing CD8+ memory T cells specific to simian immunodeficiency virus (SIV) using peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers. A pMHC-I tetramer is a complex of four MHC-I molecules bound to SIV-specific peptides and conjugated to a fluorophore. These tetramers selectively bind to T cell receptors (TCRs) on SIV-specific CD8+ T cells, facilitating the characterization of these cells.

A Peptide-MHC-I Tetramer Staining Technique to Analyze SIV-Specific CD8+ Memory T Cells

Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.

In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer antigeen-specifieke CD4+ T-cellen visualiseren met MHC klasse II tetrameren voor immunologisch onderzoek. Deze methode maakt directe detectie van specifieke T-celresponsen mogelijk.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Meer video's verkennen