Name: Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Leer hoe u HeLa-cellen infecteert met vaccinia virus en RNA extraheert op verschillende tijdstippen post-infectie voor genexpressieanalyse. Deze methode vormt de basis voor virologisch onderzoek naar virus-gastheer interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Institute Fellows fondsen

Deel 1: Het opzetten van de infectie <ol><li> Groeien HeLa cellen in flesjes en wacht tot de cellen zijn ongeveer 80% confluent. </li><li> Bereid voldoende virale groei medium voor het experiment: regelmatig DMEM met 2% FBS en geen toegevoegde antibiotica. </li><li> De infectie kan worden uitgevoerd met ofwel een ruwe voorraad van vaccinia virus met een bekende titer, of sucrose gezuiverd virus met een bekende titer als u zich zorgen over de verhuurder genexpressie. </li><li> Als u gebruik maakt van sucrose gezuiverd virus, meteen doorlopen naar deel 2. </li><li> Als u gebruik maakt van een ruwe vaccinia virus voorraad, net voor de infectie, ultrasone trillingen een hoeveelheid van het virus in een beker ultrasoonapparaat met een bad van voornamelijk ijs en een beetje water. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Ultrasone trillingen rond de 30W gedurende 20 seconden. </li><li> Vortex de buis en herhaal de sonicatie 3 keer, het toevoegen van meer ijs als dat nodig is om de beker vol met ijs en gekoeld te houden. </li><li> Vortex tussen elke ultrasoonapparaat stap. </li><li> Ga verder naar deel 2. </li></ul></li><li> Als alternatief, als je niet een kopje ultrasoonapparaat bezitten, meng een gelijk volume van de ruwe virus voorraad en 0.25mg/mL trypsine. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Vortex krachtig. </li><li> Incubeer het virus voorraad / trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten. </li><li> Vortex op 5-10 minuten. </li><li> Ga verder naar deel 2. </li></ul></li></ol> Deel 2: infecteren cellen <ol><li> Bereken de hoeveelheid virale deeltjes die nodig zijn om de monolaag te infecteren op de gewenste multipliciteit van infectie (MOI). Doorgaans wordt een hoge MOI (tussen 5 en 10) die worden gebruikt voor infectie timecourses. </li><li> Voeg de gewenste hoeveelheid sucrose gezuiverde virus of getrypsiniseerd ruwe virus tot 37 ° C virale groei media en meng goed. U moet gebruik maken genoeg media om alleen betrekking hebben op de bodem van de kolf. Bijvoorbeeld, 10 ml van media voor een T-175 kolf. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen en spoel af met kamertemperatuur PBS. </li><li> Voeg de virus / virale groei media aan elke kolf. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Roer voorzichtig, tilt platen en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 1 uur. </li><li> Kantelen en swirl platen om de 15 minuten gelijkmatig verspreiden virus en houden cellen vochtig. </li><li> Voor een 0hr/Mock tijdstip, alleen maar de virale groei van media, met geen virus toegevoegd. </li></ul></li><li> Na 1 uur incubatie, verwijder de media die het virus, en spoel drie keer met PBS kamertemperatuur. </li><li> Voeg de maximale hoeveelheid van virale groeimedium aan elke kolf. Bijvoorbeeld, 30 ml van media voor een T-175 kolf. Beginnen te tellen dit als je 0 uur tijdstip. </li></ol> Deel 3: Oogsten van cellen <ol><li> Controleer of de cellen onder een microscoop en noteer eventuele cytopathogeen effect (CPE). </li><li> Verwijder de media en spoel cellen met 30 ml van de ruimtetemperatuur PBS. </li><li> Voeg 15 ml trypsine aan de cellen en incubeer 2-5 min bij 37 ° C. </li><li> Controleer onder de microscoop voor mobiele onthechting en tik kolf cellen los te maken. </li><li> Transfer cellen met een steriele pipet serologisch in een 50 ml conische buis. </li><li> Was de kolf met een gelijk volume van de celgroei media, en voeg de media om de getrypsiniseerd cellen in de conische buis. </li><li> Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het trypsine / media uit de cel pellet. </li><li> Resuspendeer de celpellet in een van beide TRIzol reagens of de lysis buffer van uw gewenste RNA isolatie kit. </li><li> Als u gebruik maakt TRIzol, het monster te verdelen in 1 ml monsters in 1,5 ml label Eppendorf buizen en vriezen bij -80 ° C. </li><li> Herhaal dit voor alle tijden punten, de oogst een fles per tijdstip. </li></ol> Deel 4: RNA-extractie van de monsters in TRIzol <ol><li> Op dit punt, moet je monsters te worden gesuspendeerd in TRIzol reagens en klaar om te worden verwerkt. </li><li> Voeg 200μL van het BCP fasescheiding Reagens voor elke 1 ml TRIzol in elke buis. Het kan nodig zijn om het monster over te dragen aan een grotere tube als je begint met een grote hoeveelheid TRIzol. </li><li> Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. </li><li> Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant. U moet herstellen van ongeveer 600μL voor elk 1 ml van TRIzol je uit begonnen. </li><li> Doe een seconde fenol / chloroform extractie, dit keer met 500μL van chloroform per 1 ml TRIzol, in plaats van BCP. </li><li> Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. </li><li> Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant. </li><li> Voeg 20 microgram acrylamide lineaire aan elk monster. De lineaire acrylamide fungeert als een drager en helpt bij het neerslaan van de RNA. </li><li> Voeg 500 &amp; micro, L van isopropanol per 1 ml TRIzol je begonnen met aan elk monster en meng goed. </li><li> Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifuge in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 10-15 minuten. </li><li> Het RNA pellet zullen zichtbaar zijn op de bodem van de buis. Heel voorzichtig, verwijder het supernatans van de buis, hetzij met een stofzuiger aspirator, of handmatig door pipet. Niet verstoren van de pellet. </li><li> Was de pellet met 1 ml 70% ethanol. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Voeg 1 ml 70% ethanol aan de pellet. </li><li> Centrifugeer op topsnelheid 14.000 g gedurende 5-7 minuten. </li><li> Heel voorzichtig, verwijder de ethanol uit de buis, hetzij met een vacuüm aspirator, of handmatig door pipet. Controleer of de pellet zichtbaar is op de bodem van de buis. </li><li> Giet het supernatans af. </li></ul></li><li> Herhaal de wasstap. Nadat het supernatans verwijderd, markeren waar pellet is op de buis. </li><li> Drogen aan de lucht pellet niet langer dan 5 minuten. Niet Kreukherstellend, of het RNA zal moeilijk zijn te reconstrueren! </li><li> Als u de optionele DNase behandeling te volgen om alle resterende DNA uit het monster, resuspendeer de pellet in 17μL van nuclease-vrij water. Anders, resuspendeer de pellet in 20μL van nuclease-vrij water en ga naar stap 22. </li><li> (Optioneel DNase behandeling) Met behulp van de Qiagen RNase-vrij DNase set toe te voegen 2μL Buffer RDD en 1μL gereconstitueerd RNase-vrij DNase I tot en met de geresuspendeerde RNA. Meng voorzichtig. </li><li> (Optioneel DNase behandeling) Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> (Optioneel DNase behandeling) 2μL van 2,5 mM EDTA en incubeer Voeg bij 65 ° C gedurende 5 minuten om de DNase inactiveren. Niet hoger zijn dan de inactivatie tijd of temperatuur als langere tijd / hogere temperaturen kan afbraak van het RNA oorzaak. </li><li> Controleer de RNA-concentratie door de spectrofotometer. </li><li> Bewaar het RNA-monster bij -80 ° C. </li><li> (Optioneel QC) Controleer de kwaliteit van RNA met behulp van een Agilent BioAnalyzer, of door het uitvoeren van het monster op een denaturerende gel en het controleren van de OD lezingen. (260nm en 260/280 ratio) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Kritische stappen Deel 1 &amp; 2 Er zijn verschillende kritische stappen om het opzetten van een synchrone vaccinia infectie, waarvan de eerste voorzichtig sonicatie (of trypzinizing) van het virus, om virusdeeltjes splitsen. Vaccinia is zeer gevoelig voor het aggregeren, en de verstoring van het virus deeltjes is belangrijk voor het waarborgen van zelfs infectie van cellen. Met het oog op een synchrone infectie te bereiken, moet een hoog MOI (groter dan 2) worden geb...

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagens</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Vergelijkbare reagentia, zoals TriPure van Roche, werken ook.</td></tr><tr><td>BCP Fase-scheidingsreagens</td><td>Reagens</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije DNase Set</td><td>Reagens</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase-behandeling is een optionele stap.</td></tr></tbody></table>

vaccinia virus infectie en temporele analyse van de virus gene expression: deel 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

De familie<em&gt; Poxviridae</em&gt; Bestaat uit grote double-stranded DNA die virussen bevatten die uitsluitend repliceren in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen. De leden van de<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genus behoren variola, de verwekker van de menselijke pokken, apenpokken, en vaccinia (VAC), het prototype lid van het virus familie. Binnen de relatief grote (~ 200 Kb) vaccinia genoom, zijn drie klassen van genen gecodeerd: vroege, intermediaire en late. Terwijl alle drie de klassen zijn getranscribeerd door viraal gecodeerde RNA-polymerasen, elke klas heeft een ander functie in de levenscyclus van het virus. Poxviruses gebruik van meerdere strategieën voor modulatie van de host-cellulaire omgeving tijdens de infectie. Met het oog op regulering van zowel de gastheer en virus genexpressie te begrijpen, hebben we gebruik gemaakt genoom-brede aanpak van transcript overvloed analyseren van zowel virus en gastheercellen. Hier laten we zien tijdsverloop infecties van de HeLa cellen met Vaccinia virus en bemonstering RNA op verschillende tijdstippen na infectie. Zowel de host-en virale totaal RNA wordt geïsoleerd en versterkt voor hybridisatie met microarrays voor de analyse van genexpressie.

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

De familie Poxviridae bestaat uit grote virussen met dubbelstrengs DNA die zich uitsluitend repliceren in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Leden van ...

Tijdskursus-infecties van HeLa-cellen met vacciniavirus beginnen met het opzetten van de virale infecties, het infecteren van de cellen en vervolgens het oogsten van het RNA uit de geïnfecteerde cellen op verschillende tijdstippen na infectie. Dit RNA kan later worden geamplificeerd voor hybridisatie op microarrays voor de analyse van genexpressie. Hallo, ik ben Judy Ann van het laboratorium van Kate Irvins aan het Whitehead Institute for Biomedical Research.Vandaag laten we u een procedure zien voor een tijdreeksinfectie met het vacciniavirus in zoogdiercellen en de daaropvolgende RNA-extractie uit de geïnfecteerde cellen op verschillende tijdstippen na infectie. Deze techniek is een eerste stap in een uitgebreider protocol dat is gericht op het extraheren en amplificeren van RNA om de genexpressie van het virus tijdens de infectie te beoordelen, wat zal worden voltooid in twee andere JoVE-video's. Laten we beginnen. Om de infectie voor te bereiden, kweekt u HeLa-cellen in flessen en wacht u tot de cellen ongeveer 80% confluent zijn.Zorg vervolgens dat u voldoende viraal groeimedium voor het experiment bereidt. Met gebruik van regulier DMEM met 2% FBS en zonder toegevoegde antibiotica kan de infectie worden uitgevoerd met ofwel een gerecruiteerde voorraad vacciniavirus met een bekende titer, of met sucrose-gezuiverd virus met een bekende titer. Indien u bezorgd bent over de genexpressie van de gastheer en u gebruikmaakt van sucrose-gezuiverd virus, sla dan over naar de volgende sessie.Indien u een ruw vacciniavirus gebruikt, soniceer dan de voorraad en verdeel het virus in aliquots vlak voor de infectie; gebruik hiervoor een cup sonicator met een bad van voornamelijk ijs en een kleine hoeveelheid water en soniceer rond 30 W gedurende 20 seconden. Vortex de buis en herhaal de sonicatie drie keer, waarbij indien nodig extra ijs wordt toegevoegd om de beker gevuld met ijs en gekoeld te houden; zorg ervoor dat u tussen elke sonicatiestap vortex. Indien u geen cup sonicator bezit, meng dan een gelijk volume van de ruwe virusvoorraad in 0,25 mg/mL.Vortex de virusvoorraad met trypsine krachtig en incubeer deze in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten. Vortex op intervallen van vijf tot 10 minuten om de cellen te infecteren. Bereken eerst de hoeveelheid virusdeeltjes die nodig is om de monolaag te infecteren bij de gewenste multiplicity of infection.Of MOI. Doorgaans wordt een hoge MOI tussen vijf en 10 gebruikt voor infectietijdreeksen. Voeg vervolgens de gewenste hoeveelheid sucrose-gezuiverd virus of tryp-ruw virus toe aan virale groeimedia op 37 °C en meng goed.Gebruik voldoende medium om de bodem van de kolf net te bedekken. 10 milliliters medium is voldoende voor een T 1 75 kolf. Verwijder het medium van de cellen en spoel met PBS op kamertemperatuur.Voeg het virus of het virale groeimedium toe aan elke kolf voor een nulpunt-mock-tijdstip. Voeg enkel het virale groeimedium toe zonder virus, draai de platen voorzichtig rond en kantel ze; incubeer deze vervolgens één uur bij 37 °C in een 5% CO2-incubator. Zorg ervoor dat de platen elke 15 minuten worden gekanteld en rondgedraaid om het virus gelijkmatig te verspreiden en de cellen vochtig te houden.Na incubatie wordt het medium dat het virus bevat verwijderd en wordt er drie keer gespoeld met PBS op kamertemperatuur. Voeg de maximale hoeveelheid viraal groeimedium toe aan elke kolf.Gebruik bijvoorbeeld 30 milliliters medium voor een T 1 75-kolf. U kunt hiermee beginnen te tellen als uw nul-uur tijdstip op het gewenste tijdstip na de infectie. Controleer de cellen onder een microscoop en noteer eventuele cytopathische effecten of CPE.Verwijder het medium en spoel de cellen af met 30 milliliters PBS op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 15 milliliters trypsine toe aan de cellen en incubeer gedurende twee tot vijf minuten. Controleer bij 37 degrees Celsius onder een microscoop of de cellen zijn losgelaten en tik zachtjes tegen de fles om de cellen los te maken.Overbreng de cellen met een steriele serologische pipet naar een conische buis van 50 milliliter. Was de kolf met een gelijk volume celgroeimedium en voeg het medium toe aan de trypsiniseerde cellen in de conische buis. Centrifugeer de cellen bij 500 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verwijder na centrifugatie het kweekmedium van de celpellet en resuspendeer de celpellet in ofwel TRIzol-reagens of de lysisbuffer van uw gekozen RNA-isolatiekit. Als u TRIzol gebruikt, verdeel het monster dan in aliquaten van 1 ml in gelabelde Eppendorf-buisjes van 1,5 ml en vries deze in bij -80 °C. Herhaal dit voor alle tijdspunten.Oogst één kolf per tijdstip. Op dit punt moet uw monster zijn geresuspendeerd in triol-reagens en klaar zijn voor verwerking. Voeg 200 µL van het BCP-fasescheidingsreagens toe.Voor elke milliliter triol in elke buis wordt BCP of één bromo-3-chloorpropaan gebruikt in plaats van fenol. Om contaminatie met genomisch DNA te verminderen, is het mogelijk dat u het monster naar een grotere buis moet overbrengen. Als u begint met een grote hoeveelheid triol, vortex dan of schud krachtig en laat het twee tot drie minuten incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer na incubatie het monster 15 minuten bij 12.000 ×g.Een waterige fase zou zichtbaar moeten zijn als een heldere laag aan de bovenkant. Overbreng de waterige fase naar een nieuwe buis. U zou ongeveer 600 µL moeten terugwinnen voor elke milliliter triazool waarmee u bent begonnen.Voer een tweede fenol-chloroformextractie uit. Gebruik ditmaal 500 µL chloroform per één milliliter triazol in plaats van BCP. De tweede chloroformextractie wordt gebruikt om alle resten organisch oplosmiddel uit het extract te verwijderen, aangezien zelfs sporenhoeveelheden daarvan daaropvolgende amplificatiestappen kunnen remmen.Vortex of schud krachtig en laat het geheel vervolgens twee tot drie minuten incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster 15 minuten bij 12.000 GS. Breng de waterige fase over naar een nieuwe buis.Onthoud dat de waterige fase de heldere laag aan de bovenzijde is. Voeg vervolgens 20 micrograms lineair acrylamide toe aan elk monster. Het lineair acrylamide fungeert als drager en helpt bij het neerslaan van het RNA.Voeg aan elk monster 500 µL isopropanol toe per milliliter triol waarmee u bent begonnen en meng dit. Laat de monsters 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur; centrifugeer de monsters na incubatie in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 10 tot 15 minuten. Het RNA-pellet zal na centrifugatie zichtbaar zijn op de bodem van de buis.Verwijder zeer voorzichtig het supernatant uit de buis, hetzij met een vacuümaspirator of handmatig met een pipet. Verstoor het pellet niet. Was het pellet met één milliliter 70% ethanol en centrifugeer op maximale snelheid gedurende vijf tot zeven minuten.Zeer voorzichtig. Verwijder de ethanol uit de buis met een vacuümafzuiger of handmatig met een pipet. Gooi het supernatant weg.Controleer of het pellet zichtbaar is op de bodem van de buis. Herhaal deze wasstap nadat het supernatant is weggegooid. Markeer de positie van het pellet op de buis.Laat het pellet maximaal vijf minuten aan de lucht drogen. Voorkom overdroging, omdat het RNA anders moeilijk te resuspenderen zal zijn. Suspendeer het pellet vervolgens in 17 µL nucleasevrij water als een DNA-behandeling is gepland.Indien een D'S-behandeling niet is gepland, suspendeer de resus dan in 20 microliters. Gebruik voor een D'S-behandeling de KaiGen RNA free DNA-set. Voeg twee microliter buffer RDD en één microliter gereconstitueerd RNAs free toe.Voeg DNAse toe aan het resuspendeerde RNA, meng voorzichtig en incubeer 30 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens twee microliters 2,5 millimolair EDTA toe en incubeer vijf minuten bij 65 °C om het DNA te inactiveren. Overschrijd de inactiveringstijd of -temperatuur niet, aangezien langere tijden en hogere temperaturen tot degradatie van het RNA kunnen leiden.Nu is de behandeling van het DNA voltooid. Controleer de RNA-concentratie met een spectrofotometer. Sporen van fenol of BCP kunnen worden gedetecteerd als een piek bij 270 nanometer, naast de standaardpiek bij 260 nanometer.Wanneer de absorbentie van totaal RNA na extractie wordt gemeten en dergelijke contaminatie optreedt, dient het RNA opnieuw te worden gezuiverd met een filter- of kolomgebaseerde RNA-extractiemethode voordat men overgaat tot amplificatie. Het RNA-monster kan worden bewaard bij -80 °C. Indien gewenst kan de RNA-kwaliteit worden gecontroleerd met een Agilent bioanalyzer, door het monster aan te brengen op een denaturerende gel of door de OD-waarden op de bioanalyzer te controleren.Een goede RNA-kwaliteit wordt aangegeven door het RNA Integrity Number of RIN. De RIN is gebaseerd op een numeriek systeem van één tot 10, waarbij één het meest gedegradeerde profiel is en 10 het meest intacte. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een tijdreeksinfectie met het vacciniavirus uitvoert en hoe u het RNA uit geïnfecteerde cellen extraheert op verschillende tijdstippen na de infectie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er verschillende kritische stappen zijn bij het opzetten van een synchrone vaccinia-infectie. Ten eerste is een zorgvuldige sonicatie of trypsinisatie van het virus vereist. Het is belangrijk om virusdeeltjes te disaggregeren, aangezien vaccinia zeer gevoelig is voor aggregatie, wat een gelijkmatige infectie van cellen zou belemmeren.Ten tweede moet, om een asynchrone infectie te bereiken, een hoge MOI van meer dan twee worden gebruikt om ervoor te zorgen dat elke cel geïnfecteerd is. Een mengsel van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen zal leiden tot meerdere infectierondes, heterogene mengsels van tijdstippen en asynchrone virale en transcriptionele responsen van de gastheer. Ten derde moet de infectie worden uitgevoerd in minimale hoeveelheden medium om een maximale absorptie van het virus op de cellen mogelijk te maken.Daarnaast maakt het regelmatig schudden van de kolf of de kweekschalen om de 10 minuten de verspreiding van het virus over de kolf mogelijk en zorgt het ervoor dat de cellen niet uitdrogen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.Kijk zeker ook de andere video's in deze serie, waarin we de procedure voor lineaire amplificatie van RNA-monsters en de preparatie en zuivering van fluorescentisch gelabeld RNA laten zien.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Oncolytische virussen zijn veelbelovend voor kankertherapieën. De mogelijkheid om de infectability van levende weefselmonsters van patiënten voorafgaand aan de behandeling vast te stellen is een uniek voordeel van deze therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft hoe te verwerken weefsels...

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Leer hoe u HeLa-cellen infecteert met vaccinia virus en RNA extraheert op verschillende tijdstippen post-infectie voor genexpressieanalyse. Deze methode vormt de basis voor virologisch onderzoek naar virus-gastheer interacties.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Meer video's verkennen