Name: Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer vaccinia virus-infectie en genexpressie-analyse in HeLa-cellen. Dit protocol toont RNA-isolatie, reverse transcriptie en cDNA-synthese voor microarray-onderzoek naar virale en gastheer-genen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Institute Fellows fondsen

Deel 1: cDNA synthese van RNA <ol><li> Voordat u de Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, voeg dan de aanbevolen hoeveelheid van 100% ethanol aan het wassen buffers. </li><li> In PCR-reactie reageerbuis, voeg tussen 100ng aan 5μg van totaal RNA en 1μl van T7 oligo (dT) primer. Breng het volume tot 12μl met nuclease-vrij water. </li><li> Incubeer de monsters bij 70 ° C gedurende 10 min in een thermocycler. </li><li> Verwijder de RNA-monsters van 70 ° C en centrifugeer kort. Plaats op het ijs. </li><li> De voorbereiding van de 1 ste Strand Synthese master mix en houd bij kamertemperatuur (met 10% overmaat voor het pipetteren fout). (Tabel 1) </li><li> Voorzichtig pipet Master Mix of stiletto&#39;s te mengen, en centrifugeer kort. </li><li> Overdracht 8μl van de Master Mix aan elk RNA-monster. Meng door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Incubeer bij 42 ° C gedurende 2 uur in thermocycler. </li><li> Centrifugeer monsters kort en leg ze op ijs. Ga direct door naar de volgende stap van dsDNA synthese. </li><li> De voorbereiding van de 2 e Strand Synthesis master mix op ijs (met 10% overmaat voor het pipetteren fout). (Tabel 2) </li><li> Voorzichtig pipet Master Mix of stiletto&#39;s te mengen, en centrifugeer kort. </li><li> Overdracht 80μl aan elk monster en meng door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Incubeer bij 16 ° C gedurende 2 uur in thermocycler. </li><li> Na de 2 uur incubatie, verder met de cDNA clean-up stap of bevriezen onmiddellijk bij -20 ° C. </li></ol> Deel 2: Double-cDNA clean-up <ol><li> Haal de cDNA Pure uit de koelkast en laat het tot kamertemperatuur temp equilibreren gedurende 30 minuten vóór gebruik. Schud de fles volledig de magnetische cDNA binding bolletjes mengen voor gebruik. </li><li> Aliquot nuclease-vrij water in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten tijdens de vorige 2 uur incubatie. </li><li> Voeg 180μl van cDNA Pure aan elk monster, en meng grondig door en neer te pipetteren. Overdracht van de monsters naar een 96-goed-ronde bodemplaat. </li><li> Blijf de monsters mix door voorzichtig schudden van de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. Laat plaat op de stand voor ongeveer 6 minuten, of tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Voeg 150μl cDNA wasbuffer aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Kralen zal NIET verspreiden op deze stap, vanwege de lage oppervlaktespanning van de wasbuffer. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 150μl cDNA Wash Buffer. </li><li> Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 2 minuten op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend! </li><li> Elueren het cDNA van de kralen door het toevoegen van 18μl van de voorverwarmde nuclease-vrij water aan elk monster. </li><li> Schud de plaat gedurende 3 minuten op de rondschudapparaat, kijk dan te zorgen dat de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden. </li><li> Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. </li><li> Zorgvuldig de geëlueerde cDNA (~ 16μl) over te dragen aan een nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen). </li><li> Ga direct naar de volgende stap, of het bevriezen van de cDNA bij -20 ° C. </li></ol> Deel 3: in vitro transcriptie (IVT) <ol><li> Bereid de IVT master mix op kamertemperatuur. (Tabel 3) </li><li> Voorzichtig pipet de Master Mix of stiletto&#39;s te mengen, en centrifugeer kort. </li><li> Voeg 24μl aan elk monster, en meng door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur in een thermocycler, houd dan bij 4 ° C tot aan de volgende stap. </li></ol> Deel 4: ARNA clean-up na IVT <ol><li> Vortex het RNA binden beads kort om een ​​homogene massa te verkrijgen voor gebruik. </li><li> Bereid de ARNA Binding Mix bij kamertemperatuur (tabel 4) Dit kan van tevoren worden gedaan. - De voorbereide binding mix kan bewaard worden bij kamertemperatuur tot maximaal een week. </li><li> Meng goed door vortexen. </li><li> Aliquot Het Arna elutiebuffer in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Voeg 70μl van de ARNA binding mixaan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Overdracht van de monsters van de PCR-plaat tot een 96-goed-ronde bodemplaat. </li><li> Voeg 50μl van 100% isopropanol aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Schud de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten grondig mengen van de monsters. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. Laat de plaat op de stand tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Voeg 100μl ARNA Wash Solution aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Korrels kunnen niet volledig uiteen bij deze stap. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 100μl ARNA Wash Solution. </li><li> Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 1 minuut op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend samples! </li><li> Elueren Het Arna van de kralen door het toevoegen van 40μl voorverwarmde ARNA elutiebuffer aan elk monster. </li><li> Schud de plaat op de orbitale schudder gedurende 3 minuten, daarna moet u controleren of de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden. </li><li> Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. Het supernatant bevat de schoon-up amino-allyl opgenomen ARNA. </li><li> Breng voorzichtig de geëlueerd ARNA om een ​​nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen). </li><li> (Optioneel stap) Controleer de RNA-concentratie van de monsters door het meten van 1.5μl op een NanoDrop spectrofotometer. </li><li> Onmiddellijk verder naar de volgende stap, of op te slaan Het Arna bij -80 ° C. </li></ol> Tabel 1: cDNA 1 e Strand Synthese Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag voor een reactie </td></tr><tr><td> 10X Eerste Strand Buffer </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Ribonucleaseremmer </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Array Script </td><td> 1 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 2: cDNA 2 e Strand Synthese Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag voor een reactie </td></tr><tr><td> Nuclease gratis water </td><td> 63 pl </td></tr><tr><td> 10X Tweede Strand Buffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> DNA Polymerase </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag voor een reactie </td></tr><tr><td> aaUTP oplossing (75 mM) </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 pl </td></tr><tr><td> T7 UTP-oplossing (75 mM) </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 10X reactiebuffer </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 pl </td></tr></tbody></table> Tabel 4: ARNA Binding Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag voor een reactie </td></tr><tr><td> RNA-Bindende Kralen * </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> Bead resuspensie Oplossing * </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 100% isopropanol ** </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> ARNA Binding Buffer Concentrate </td><td> 50 ui </td></tr></tbody></table> * Het RNA binden kralen eerste mix met de kraal resuspensie oplossing. ** Voeg de isopropanol en meng goed voor het toevoegen van de ARNA bindende buffer concentreren.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Kritische stappen Een tweede ronde van de versterking wordt afgeraden als vooroordelen in array data zijn waargenomen. Het mengen van zorgvuldig bij elke enzymatische stap (1 e en 2 e streng cDNA synthese, IVT) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een goede versterking opbrengst, net als incubatie van elk enzymatische stap voor stap de juiste temperatuur. Een PCR cycler met verstelbare verwarmde deksel heeft de voorkeur - zelfs afwijkingen zo klein als 2-3 grade...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplificatiekit</td><td>Reagens</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Voor 20 reacties</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplificatiekit</td><td>Reagens</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Voor 100 reacties, in een 96-well formaat</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrofotometer</td><td>Overig</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Of een gelijkwaardige spectrofotometer</td></tr></tbody></table>

vaccinia virus infectie en temporele analyse van de virus gene expression: deel 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

De familie<em&gt; Poxviridae</em&gt; Bestaat uit grote double-stranded DNA die virussen bevatten die uitsluitend repliceren in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen. De leden van de<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genus behoren variola, de verwekker van de menselijke pokken, apenpokken, en vaccinia (VAC), het prototype lid van het virus familie. Binnen de relatief grote (~ 200 Kb) vaccinia genoom, zijn drie klassen van genen gecodeerd: vroege, intermediaire en late. Terwijl alle drie de klassen zijn getranscribeerd door viraal gecodeerde RNA-polymerasen, elke klas heeft een ander functie in de levenscyclus van het virus. Poxviruses gebruik van meerdere strategieën voor modulatie van de host-cellulaire omgeving tijdens de infectie. Met het oog op regulering van zowel de gastheer en virus genexpressie te begrijpen, hebben we gebruik gemaakt genoom-brede aanpak van transcript overvloed analyseren van zowel virus en gastheercellen. Hier laten we zien tijdsverloop infecties van de HeLa cellen met Vaccinia virus en bemonstering RNA op verschillende tijdstippen na infectie. Zowel de host-en virale totaal RNA wordt geïsoleerd en versterkt voor hybridisatie met microarrays voor de analyse van genexpressie.

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

De familie Poxviridae bestaat uit grote virussen met dubbelstrengs DNA die zich uitsluitend repliceren in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Leden van ...

Hallo, ik ben Judy Yen van het laboratorium van Kate Rubins aan het Whitehead Institute for Biomedical Research. Na het infecteren van HeLa-cellen met het vacciniavirus en het isoleren van totaal RNA, zoals getoond in een eerder JoVE-videoprotocol, kunnen viraal RNA worden geïsoleerd en geamplificeerd middels reverse transcriptie en in vitro transcriptie; het geamplificeerde RNA zal later worden gebruikt in microarray-analyse van virale en gastheer-genexpressie. Laten we beginnen.Om deze cDNA-synthese uit RNA te starten, voegt u het aanbevolen volume 100% ethanol toe aan de wasbuffers voordat u de ambient amino allele message AMP two kit gebruikt. Voeg in een PCR-reactiebuis tussen 100 ng en 5 µg totale RNA en 1 µL T7-oligoprimer toe. Vul het volume aan tot 12 µL met nucleasevrij water. Incubeer de monsters 10 minuten bij 70 °C in een thermocycler.Verwijder vervolgens de RNA-monsters uit de centrifuge bij 70 °C. Plaats de monsters na centrifugatie kort op ijs. Bereid de mastermix voor de eerste-strengsynthese voor met een volumeoverschot van 10% om pipetteerfouten op te vangen.Laat het op kamertemperatuur komen, pipetteer de mastermix voorzichtig of tik het mengsel kort aan om te mengen, en centrifugeer vervolgens kort. Draag na centrifugatie 8 µL van de mastermix over naar elk RNA-monster en meng door drie tot vier keer op en neer te pipetteren. Incubeer 2 uur lang bij 42 °C in een thermocycler. Centrifugeer de monsters na incubatie kort en plaats ze op ijs. Ga onmiddellijk over naar de volgende stap van de dsDNA-synthese.Bereid de mastermix voor de synthese van de tweede streng op ijs voor met een volume-overschot van 10% om pipetteerfouten te compenseren. Pipetteer de mastermix voorzichtig of tik tegen de zijkant van de buis en centrifugeer vervolgens kort. Breng 80 µL over naar elk monster en meng voorzichtig door drie tot vier keer op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende twee uur bij 16 °C in de thermocycler.Na de incubatie van twee uur volgt de stap voor de cDNA-reiniging, of het monster wordt onmiddellijk ingevroren bij -20 °C. Om te beginnen met de reiniging van dubbelstrengs cDNA: haal eerst de cDNA pure uit de koelkast en laat deze 30 minuten lang acclimatiseren naar kamertemperatuur vóór gebruik. Schud de fles om de magnetische cDNA-bindingsbeads vóór gebruik volledig te resuspenderen. Pipetteer nucleasevrij water in een 1,5 ml buisje en incubeer dit gedurende ten minste 10 minuten bij 50 tot 60 °C.Voeg tijdens de voorgaande incubatie van twee uur 180 µL CD NA pure toe aan elk monster en meng dit grondig door met de pipet op en neer te pipetteren. Breng de monsters over naar een 96-wells plaat met ronde bodem. Nadat de monsters naar een plaat zijn overgebracht, worden ze verder gemengd door de plaat gedurende ten minste twee minuten voorzichtig te schudden op een orbital shaker.Plaats de plaat op een magnetische houder om de magnetische beads op te vangen. Laat de plaat ongeveer zes minuten op de houder staan, of totdat het mengsel transparant wordt en de bindende beads zijn gepelletteerd. Aspireer voorzichtig het supernatant met een vacuümaspirator zonder de magnetische beads te verstoren.Verwijder alternatief voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant weg. Nadat het supernatant is weggegooid, wordt de plaat van de magneet verwijderd. Voeg vervolgens 150 µL cDNA-wasbuffer toe aan elke put en schud de plaat gedurende één minuut op de orbitale schudder bij een matige snelheid.De beads zullen in deze stap niet dispergeren vanwege de lage oppervlaktespanning van de wasbuffer. Plaats de plaat na het schudden terug op een magneetrek. Om de magnetische beads vast te houden, wordt het supernatant voorzichtig met een vacuümaspirator afgezogen zonder de magnetische beads te verstoren.Of verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant weg. Haal de plaat van het magnetisch rek. Herhaal de wasstap een tweede keer met 150 µL cDNA-wasbuffer.Droog na de tweede wasbeurt de beads door de plaat twee minuten lang op de maximale snelheid op de orbital shaker te schudden. Het is belangrijk dat de beads niet te veel uitdrogen. Elueer vervolgens het cDNA van de beads door aan elk monster krachtig 18 µL van het voorverwarmde nucleasevrije water toe te voegen.Schud de plaat drie minuten op de orbitale schudder. Controleer vervolgens of de magnetische korrels volledig zijn gedispergeerd. Zo niet, schud dan verder.Zodra de magnetische kraaltjes volledig zijn gedispergeerd, plaatst u de plaat op een magnetische standaard. Om de magnetische kraaltjes op te vangen, brengt u het geëlueerde cd NA zorgvuldig over naar een nieuwe PCR-plaat of PCR-buisjes. U zou per monster ongeveer 16 microliter van het eluaat moeten terugwinnen.Ga direct door naar de volgende stap of vries de cDNA aan bij -20 °C. Bereid de IVT-mastermix voor bij kamertemperatuur. Pipetteer de mastermix voorzichtig of meng door te tikken en centrifugeer kort.Voeg na centrifugatie 24 µL toe aan elk monster en meng dit voorzichtig door drie tot vier keer met de pipet op en neer te zuigen; incubeer vervolgens 14 uur bij 37 °C in een thermocycler. Bewaar het daarna bij 4 °C tot de volgende stap; vortex de RNA-bindingskraaltjes kort voor gebruik om een homogeen mengsel te verkrijgen. Bereid de A RNA-bindingsmix voor bij kamertemperatuur.Dit kan vooraf worden gedaan. Het bereide bindingsmengsel kan tot één week bij kamertemperatuur worden bewaard. Meng goed door te vortexen; breng een aliquot van de A RNA-elutiebuffer over in een buisje van 1,5 milliliter en incubeer bij 50 tot 60 °C gedurende ten minste 10 minuten.Voeg nu 70 µL van de A RNA-bindingsmix toe aan elk monster en meng goed door drie tot vier keer op en neer te pipetteren. Breng de monsters over van de PCR-plaat naar een 96-wells plaat met ronde bodem. Voeg vervolgens 50 µL van honderd procent isopropanol toe aan elk monster en meng goed door drie tot vier keer op en neer te pipetteren.Schud de plaat voorzichtig gedurende ten minste twee minuten op een orbitale schudmachine. Verplaats de plaat vervolgens naar een magnetische standaard om de monsters grondig te mengen en de magnetische kralen op te vangen.Laat de plaat op het statief staan totdat het mengsel transparant wordt en de bindingskraaltjes zijn neergeslagen. Nadat de kraaltjes zijn neergeslagen, wordt het supernatant voorzichtig afgezogen met de vacuümaspirator zonder de magnetische kraaltjes te verstoren. Als alternatief kan het supernatant voorzichtig met een pipet worden verwijderd en weggegooid.Verwijder de plaat van het magnetische rek. Voeg vervolgens 100 µL RNA-wasoplossing toe aan elke put en schud de plaat gedurende één minuut op de orbitale schudder bij een matige snelheid; de korrels hoeven niet volledig te dispergeren. Plaats de plaat bij deze stap op een magnetisch rek.Om de magnetische kraaltjes op te vangen. Aspireer het supernatant voorzichtig met een vacuümaspirator zonder de magnetische kraaltjes te verstoren. Verwijder anderszins het supernatant voorzichtig met een pipet en gooi het supernatant weg.Zodra het supernatant is verwijderd, wordt de plaat van de magnetische standaard gehaald. Herhaal de wasstap voor een tweede maal met 100 µL RNA-wasoplossing. Droog na de tweede wasbeurt de beads door de plaat gedurende één minuut op de orbitale schudmachine op maximale snelheid te schudden.Zorg ervoor dat de monsters niet te ver uitdrogen. Elueer het A RNA uit de beads door 40 µL voorverwarmde A RNA-elutiebuffer toe te voegen. Schud de plaat voor elk monster gedurende drie minuten krachtig op de orbitale shaker. Controleer vervolgens of de magnetische beads volledig zijn gedispergeerd.Zo niet, schud dan verder. Zodra de magnetische kralen volledig zijn gedispergeerd, wordt de plaat naar een magnetische standaard verplaatst om de magnetische kralen op te vangen. De supernatant bevat het gezuiverde amino-allel, geïncorporeerd in een RNA.Breng het geëlueerde RNA zorgvuldig over naar een nieuwe PCR-plaat of PCR-buisjes. Op dit punt kunt u de RNA-concentratie van de monsters controleren door 1,5 µL te meten op een NanoDrop-spectrofotometer. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap of bewaar het RNA bij -80 °C.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe gefluoresceerde labeling van geamplificeerde immuno-allel-geïncorporeerde RNA-monsters voor microarray-hybridisatie wordt uitgevoerd. Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een tweede amplificatieronde wordt afgeraden. Omdat er biases en afwijkingen in de array-data zijn waargenomen, is het tevens belangrijk om te onthouden dat zorgvuldig mengen bij elke enzymatische stap essentieel is voor zowel de eerste als de tweede streng.De synthese van cDNA, of de IVT-stap, is cruciaal voor het verkrijgen van goede amplificatieopbrengsten, evenals de incubatie van elke enzymatische stap bij de juiste temperatuur. Een PCR-cycler met een verstelbare verwarmde klep heeft de voorkeur, aangezien zelfs afwijkingen van slechts twee tot drie graden tijdens de in vitro transcriptie in een luchthybridisatieoven of waterbad de opbrengst van het geamplificeerde product aanzienlijk kunnen beïnvloeden.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Vergeet niet om de andere video's in deze serie te bekijken, waarin we laten zien hoe u een tijdserie-infectie met het vacciniavirus uitvoert, hoe u RNA uit de monsters extraheert en hoe u fluorescent gelabeld RNA bereidt en zuivert.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Oncolytische virussen zijn veelbelovend voor kankertherapieën. De mogelijkheid om de infectability van levende weefselmonsters van patiënten voorafgaand aan de behandeling vast te stellen is een uniek voordeel van deze therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft hoe te verwerken weefsels...

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Leer vaccinia virus-infectie en genexpressie-analyse in HeLa-cellen. Dit protocol toont RNA-isolatie, reverse transcriptie en cDNA-synthese voor microarray-onderzoek naar virale en gastheer-genen.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Meer video's verkennen