Name: Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer exocytose meten in neuronen met FM 4-64 kleuring voor neurotransmissieonderzoek. Deze methode gebruikt hippocampale neuronculturen en real-time beeldvorming om vesikelvrijgavekinetiek te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cellen: Rat (of muis) primaire hippocampale neuronale culturen (14-28 dagen in vitro). Stimulatie: Elektrische, geleverd via twee platina-elektroden; 70-90 mV Microscopie: 60x olie lens op een omgekeerde CCD fluorescentiemicroscoop. Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA) Zie aanvullende methoden pagina voor meer details <ol><li> Warm HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) op kamertemperatuur. Voeg de glutamaat receptor antagonisten APV (50 uM eindconcentratie) en CNQX (10 uM def.) Elke FM-experiment vereist meestal 20 tot 30 ml HBS. Voor het werken concentratie van 10 uM FM 4-64 (Molecular Probes), vul voorraad oplossing 1:1000 in HBS (met antagonisten toegevoegd). Maak 2 mL FM Soln voor elk experiment. Bedek oplossing met folie om blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> Monteer de dekglaasje met de neuronen op de elektrode kamer. Controleer of de media in de kamer is het niveau met de bovenkant van kamer en volledig bedekt de elektroden. Verwijder eventuele overtollige oplossing van de onderkant van dekglaasje aan. Voeg olie aan de lens (bij gebruik van een olie-lens). </li><li> Stel de perfusie apparaat. Eerst spoelen met een paar ml van elk van de volgende in de aangegeven volgorde (grondig laten elk een stroom voor het toevoegen van de volgende): water, ethanol, water, dan HBS. Voeg vervolgens de HBS (behoudens enkele mL toe te voegen met de hand in de toekomst stappen) en sluit de perfusie. Stel de perfusie stopcontact en de zuigkracht aan weerszijden aan de randen van het dekglaasje. Het is het beste als de perfusie outlet tot in de kamer, waar als de afzuiging dient te rusten op de top. Terwijl het toevoegen van HBS (hetzij door perfusie of met de hand), open de zuig-en pas de positie, zodat het houdt de media op het juiste niveau, net volledig over de elektroden. </li><li> Kijk voor het gebied op het dekglaasje u wilt om de afbeelding en probeer ongeveer brengen in focus. Optimale gebieden bevatten veel synapsen, maar moet niet zo dicht zodat de individuele processen te onderscheiden te worden. Er mag geen-to-minimal cellichamen, vreemde membranen (zoals pollen van astrocyten), of andere niet-specifieke materialen (zoals lint). De FM-kleurstof kan zich aan deze niet-specifiek. </li><li> Gebruik de &quot;werkgroep&quot; filter kubus (die prikkelt met groen licht en verzamelt rood-to-ver rode emissies). Stel SlideView &quot;capture voorkeuren&quot; om 900 AP leveren bij 10 Hz bij aanvang van de afbeelding 0 (meestal 300 tot 900 access points worden gebruikt voor het laden van deze stimulus). In het beeld-venster, selecteer de &quot;fluo-vis-rood&quot; filter instellingen en verander de blootstelling tijd tot 100 ms. Schakel alle reeds bestaande timelapse-instellingen. Neem geen foto&#39;s totdat u klaar bent om de stimulatie te starten. </li><li> Zorg ervoor dat de zuigkracht is op / open. Snel toe te voegen van de FM-Soln (2 ml) om de kamer aan de andere kant van de zuigkracht. Meteen goed druk in de afbeelding venster om een ​​afbeelding te nemen en stimulatie beginnen. Wacht 30-45 seconden na stimulatie en dan snel wassen FM door het toevoegen van ~ 2 mL van HBS (Ik doe dit met de hand met een pipet, maar dit kan ook gebeuren door perfusie worden). </li><li> Was de FM met HBS via perfusie voor ~ 10 minuten. Het debiet moet 1 tot 1,5 ml / min zijn. Tijdens deze wasstap, wijzigt u de stimulatie voorkeuren, zodat het begin van de stimulatie begint @ image 10 (meestal 900 tot 1200 AP @ 10 Hz worden gebruikt voor deze ontkleuren stimulus). Ongeveer 7 min in de was, controleer de voorkeuren (begin van de stimulus afbeelding 10). Nu het gebruik van de kleine focus venster kiezen en focus een subregio. Zorg ervoor dat de stimulatie-instellingen zijn gewijzigd voordat u verder gaat naar de volgende stap. Neem een ​​enkel beeld om te zien of de was is compleet (individuele synapsen moet duidelijk worden punctated). Zo niet, verhoging van de stroomsnelheid een extra 0.5mL/min, en wacht nog 2 minuten. </li><li> Was eenmaal is voltooid, stelt u de belichting tijd als nodig is om nog steeds ontvangt een goed, duidelijk signaal (meestal tussen 50-100 ms. Belichtingstijden moet gevolg van de snelle fotobleken van de FM worden geminimaliseerd). Stel vervolgens de timelapse voorkeuren te nemen 38 beelden om de 5 seconden. Controleer de perfusie te maken is er genoeg HBS nog 5 minuten en laat perfusie stromen. Start timelapse om te beginnen ontkleuren. </li><li> Na destain, veranderen stimulatie-instellingen tot 1200 AP @ 10Hz (meestal 1200-2000 AP&#39;s zijn gebruikt voor dit laatste stap) te leveren op afbeelding 0. Schakel de timelapse instellingen en neem een ​​enkel beeld voor stimulatie beginnen. De perfusie moet nog steeds stromen Deze stap zal helpen alle resterende vesiculaire FM kleurstof, om baseline / &quot;totaal vrij te geven&quot; fluorescentie te bepalen. Nadat de stimulus is voltooid, schakelt u de stimulatie-instellingen, te brengen in de regio in beeld. Sluit de perfusie en zuig, En neem dan twee laatste baseline beelden. Ofwel losse foto&#39;s of Z-stack beelden (0,5 micrometer stappen) kunnen worden genomen. Z-stacks zijn nuttig voor het geval er was een verschuiving in het vlak van de focus tijdens het experiment. </li><li> Uw FM-experiment is gedaan. Indien onmiddellijk doen meer experimenten, moet de lens en de kamer schoongemaakt worden tussen elke proef, maar de perfusie apparaat hoeft niet te worden schoongemaakt pas na het laatste experiment. Volledig Spoel het apparaat met water, dan ethanol. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Als 300 actiepotentialen (AP&#39;s) is voldoende om tenminste een ronde van blaasje recycling, een laad-stimulus van 300 AP&#39;s of meer wordt vaak gegeven aan het etiket van de recycling pool van blaasjes veroorzaken. Hoewel de meer intense laden stimuli, zoals 900 AP, kan toestaan ​​dat een nominale aantal extra blaasjes te worden geëtiketteerd, dit verhoogt ook de hoeveelheid tijd die de kleurstof kan insluiten in extracellulaire membranen, wat leidt tot een grotere niet-specifieke kleuring. Ik heb de wasstap om kritisch om een ​​goede ...

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>CNQX-dinatriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van exocytose in neuronen fm-ontvanger voor labeling

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes voorzien van FM kleurstof om de snelheid van presynaptische blaasje los te controleren. FM4-64 is een rood fluorescerende amfifiele styrylkleurstoffen kleurstof die integreert in de membranen van synaptische blaasjes als endocytose wordt gestimuleerd. Lipofiele interacties zorgen dat de kleurstof om sterk te verhogen in fluorescentie, dus uitzenden van een helder signaal wanneer geassocieerd met blaasjes en een nominale een toen in de extracellulaire vloeistof. Na een wasstap wordt gebruikt om externe kleurstof te verwijderen binnen de plasmamembraan, wordt de resterende FM geconcentreerd in de blaasjes en wordt dan verwijderd wanneer exocytose wordt veroorzaakt door een andere ronde van elektrische stimulatie. De snelheid van blaasjes release is gemeten vanaf de daaruit voortvloeiende daling van de fluorescentie. Omdat FM kleurstof kan worden toegepast externe en tijdelijk, het is een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van de tarieven van de exocytose in neuronale culturen, vooral bij het vergelijken van de tarieven tussen getransfecteerde synapsen en naburige controlegebieden boutons.

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasjesvrijgave te meten, kan helpen bij het verkrijgen van inzicht in enkele basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we realtime ...

Ik ben Jimmy Lynn. Ik ben een promovendus in het programma Moleculaire en Cellulaire Biologie aan Harvard. Momenteel werk ik in het Murphy Lab, waar we in het laboratorium onderzoek doen naar hippocampale neuronen.En nu ga ik u laten zien hoe u FM-experimenten uitvoert. We gaan nu het dekglas met daarop de neuronen monteren in deze op maat gemaakte kamer. Onze microscoop is een omgekeerde CCD; zorg ervoor dat de onderkant grondig wordt afgedroogd.Nu gaan we de elektroden aansluiten. Nu de perfusie is ingesteld, ga ik deze aan één uiteinde van de kamer plaatsen.We gebruiken klei voor de fixatie. De verantwoordelijken voor HBS per experiment zullen dit vervolgens toevoegen. De fusie is ingesteld.U kunt klei gebruiken om dit op zijn plaats te houden, ik vermoed zoals dit deel dat cellichamen bevat, omdat de membranen van de cellichamen veel kleurstof zullen opnemen en veel rechtstreeks in de synapsen zullen terechtkomen. Misschien een aangrenzend gebied zoals hier, waar ik dit gebied onmiddellijk had en we verder gaan. En dus de initiële fotobleking van de eerste 10 afbeeldingen.En hier is waar, dus ik ben Jamil Newton. Ik ben een promovendus in het programma moleculaire biologie hier

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

In this video, Drosophila larvae nerve fibers are immersed in FM dye, which binds to cell membrane lipids. Suction microelectrode and electrical pulses stimulate the endocytosis process, incorporating the FM dye into newly formed endocytic vesicles. This method, which visualizes presynaptic stages of neurotransmission, is useful for studying synaptic function and neurotransmitter release.

Microelectrode-Mediated FM Dye Loading and Unloading in Drosophila Larvae Nerve Cells

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Hier beschrijven we een nieuwe voorbereiding voor het beeldvormen van levende lancetvormige sensorische terminalen van palissade-uiteinden die tijdens kleuring en ontkleur met styryl pyridinium kleurstoffen de haarzakjes van de muizenoorhuid innerveren.

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Leer exocytose meten in neuronen met FM 4-64 kleuring voor neurotransmissieonderzoek. Deze methode gebruikt hippocampale neuronculturen en real-time beeldvorming om vesikelvrijgavekinetiek te analyseren.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

Meer video's verkennen