Name: Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer RNA-labeling met amino-allyl-koppeling van kleurstoffen voor microarray-analyse van vaccinia virus-geïnfecteerde HeLa-cellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar genexpressie in virologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Institute Fellows fondsen

Deel 1: ARNA etikettering: aminozuren allyl koppeling van de kleurstoffen <ol><li> Voeg 1μg van de ARNA monsters in 1,5 ml microcentrifuge buizen. </li><li> Vacuüm droog de monsters op een laag of geen vuur tot ze helemaal droog zijn. Cap elke buis, zodra het droog is - niet Kreukherstellend! </li><li> Voeg 9μl koppeling buffer aan elke buis en resuspendeer de ARNA door voorzichtig vortexen gedurende 1 minuut. Centrifugeer kort aan het monster te verzamelen in de bodem van de buis, en laat het monster zitten op het ijs. </li><li> Voeg 22μl hoge kwaliteit DMSO aan elke buis van Cy3 of Cy5 kleurstof. Een tube van de kleurstof is genoeg voor 2 monsters. De Cy3 kleurstof is voor het labelen van uw referentie monsters, en de Cy5 kleurstof is voor het labelen van de test monsters. </li><li> Vortex de kleurstoffen aan goed te mengen. Houd de kleurstoffen in het donker pas klaar voor gebruik. Niet voor te bereiden kleurstof eerder dan 1 uur voor gebruik. Zorg dat er geen water krijgt in de kleurstof / DMSO mix op elk punt. </li><li> Voeg 11μl van de bereide DMSO / Cy kleurstof aan elk monster. Meng goed door vortexen voorzichtig. </li><li> Incubeer gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren. </li><li> Na de incubatie, voeg 4.5μl hydroxlyamine aan elk monster om de reactie te doven. Meng goed door vortexen voorzichtig. </li><li> Incubeer gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur. Bedek de monsters met aluminiumfolie of houd ze in een lade om de blootstelling aan het licht te minimaliseren. </li></ol> Deel 2: Labeled ARNA clean-up <ol><li> Vortex het RNA binden beads kort om een ​​homogene massa te verkrijgen voor gebruik. </li><li> Bereid de ARNA Binding Mix op kamertemperatuur. (Tabel 1) </li><li> Meng goed door vortexen. </li><li> Aliquote Het Arna elutiebuffer in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Voeg 70μl van de ARNA binding mix aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Overdracht van de monsters van de PCR-plaat tot een 96-goed-ronde bodemplaat. </li><li> Voeg 50μl van 100% isopropanol aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer. </li><li> Schud de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten grondig mengen van de monsters. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. Laat de plaat op de stand tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. Het supernatant moeten ofwel een fel roze of een heldere blauwe op dit punt te wijten aan de niet opgenomen kleurstof moleculen. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Voeg 100μl ARNA Wash Solution aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Korrels kunnen niet volledig uiteen bij deze stap. </li><li> Verplaats de plaat een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant. </li><li> Haal de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 100μl ARNA Wash Solution. </li><li> Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 1 minuut op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend samples! </li><li> Elueren Het Arna van de kralen door het toevoegen van 20μl voorverwarmde ARNA elutiebuffer aan elk monster. </li><li> Schud de plaat op de orbitale schudder gedurende 3 minuten, daarna moet u controleren of de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden. </li><li> Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan ​​om de magnetische korrels vast te leggen. Het supernatant bevat het opgeruimd, gelabeld ARNA monsters, en moet worden ofwel een bleke roze of een lichtblauw. </li><li> Breng voorzichtig de geëlueerd ARNA om een ​​nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen). </li><li> (Optioneel stap) Controleer de RNA-concentratie en de hoeveelheid kleurstof in de monsters door het meten van 1.5μl op een NanoDrop spectrofotometer met behulp van de Microarray module. </li><li> Onmiddellijk hybridiseren de gelabelde ARNA op een microarray platform van uw keuze, of als alternatief, kunt u de gelabelde ARNA bewaren bij -80 ° C tot je klaar bent voor hybridisatie. </li></ol> Tabel 1 ARNA Binding Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag voor een reactie </td></tr><tr><td> RNA-Bindende Kralen * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Bead resuspensie Oplossing * </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% isopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Binding Buffer Concentrate </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * Meng de RNA-bindend kralen met dekraal resuspensie oplossing eerst ** Voeg de isopropanol en meng goed voor het toevoegen van de ARNA bindende buffer concentreren.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Kritische stappen Bij het uitvoeren van het amino-allyl koppeling, is het essentieel om de kleurstof hersuspenderen in DMSO kort (minder dan 1 uur) voor het koppelen en er geen water in de kleurstof / DMSO mix, want het zal reageren met de actieve groep van de kleurstof te verzekeren. Niet Kreukherstellend RNA (kan gedroogd worden tot 1-2uL in plaats van volledig droog), en goed in de koppeling buffer resuspenderen. Tijdens de koppeling reactie, houden de reactie in het donker, met af en toe f...

<table><tbody><tr><td>CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Bevat zowel Cy3- als Cy5-kleurstoffen</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td><td>Overig</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Of gelijkwaardige spectrophotometer</td></tr></tbody></table>

vaccinia virus infectie en temporele analyse van de virus gene expression: deel 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

De familie<em&gt; Poxviridae</em&gt; Bestaat uit grote double-stranded DNA die virussen bevatten die uitsluitend repliceren in het cytoplasma van de geïnfecteerde cellen. De leden van de<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genus behoren variola, de verwekker van de menselijke pokken, apenpokken, en vaccinia (VAC), het prototype lid van het virus familie. Binnen de relatief grote (~ 200 Kb) vaccinia genoom, zijn drie klassen van genen gecodeerd: vroege, intermediaire en late. Terwijl alle drie de klassen zijn getranscribeerd door viraal gecodeerde RNA-polymerasen, elke klas heeft een ander functie in de levenscyclus van het virus. Poxviruses gebruik van meerdere strategieën voor modulatie van de host-cellulaire omgeving tijdens de infectie. Met het oog op regulering van zowel de gastheer en virus genexpressie te begrijpen, hebben we gebruik gemaakt genoom-brede aanpak van transcript overvloed analyseren van zowel virus en gastheercellen. Hier laten we zien tijdsverloop infecties van de HeLa cellen met Vaccinia virus en bemonstering RNA op verschillende tijdstippen na infectie. Zowel de host-en virale totaal RNA wordt geïsoleerd en versterkt voor hybridisatie met microarrays voor de analyse van genexpressie.

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

De familie Poxviridae bestaat uit grote virussen met dubbelstrengs DNA die zich uitsluitend repliceren in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Leden van ...

Hoi, ik ben Judy Y van het laboratorium van Kate Rubins aan het Whitehead Institute for Biomedical Research. Hier demonstreer we hoe antisense RNA-monsters, verzameld uit zowel met vacciniavirus geïnfecteerde HeLa-cellen als uit het virus zelf, gelabeld kunnen worden door middel van amino-allyl-koppeling van kleurstoffen. Vervolgens laten we zien hoe het gelabelde antisense RNA wordt gezuiverd en voorbereid om te worden gehybridiseerd voor microarray-analyse van genexpressie.Eerdere JoVE-video's laten zien hoe de virale infecties, totale RNA-isolatie en de stappen voor RNA-amplificatie moeten worden uitgevoerd. Laten we beginnen. Om te starten met de RNA-labeling, voegt u eerst 1 µg van de RNA-monsters toe aan 1,5 ml microcentrifugebuisjes.Vacuümdroog de monsters bij lage temperatuur of zonder warmte tot ze volledig droog zijn. Sluit elk buisje af zodra het droog is. Het is belangrijk om de monsters niet te overdrogen nadat ze zijn opgedroogd.Voeg negen µL koppelingsbuffer toe aan elke buis en resuspendeer het A-RNA door één minuut voorzichtig te vortexen; centrifugeer kort om het monster onderin de buis te verzamelen en laat het monster vervolgens op ijs rusten. Voeg daarna 22 µL

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Oncolytische virussen zijn veelbelovend voor kankertherapieën. De mogelijkheid om de infectability van levende weefselmonsters van patiënten voorafgaand aan de behandeling vast te stellen is een uniek voordeel van deze therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft hoe te verwerken weefsels...

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Leer RNA-labeling met amino-allyl-koppeling van kleurstoffen voor microarray-analyse van vaccinia virus-geïnfecteerde HeLa-cellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar genexpressie in virologie.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

Meer video's verkennen