Op lange termijn Imaging zoogdiercellen met behulp van Wide-Field Microscopie

Wat ik nu ga doen, is het hier eerst monteren en daarna u vervangen. Nu ga ik aspireren en proberen dit zo voorzichtig mogelijk te doen. Oké. Een paar seconden gewoon vasthouden. Oké. Voorbij.

De belangrijkste kenmerken van ons lifestyle imaging-grid zijn dat het een geïnverteerde microscoop is, wat betekent dat het objectief en de monsters zich hieronder bevinden. Het objectief is dus naar boven gericht en de gehele microscoop, of in ieder geval nagenoeg de hele microscoop, inclusief de objectieven en het monster, bevindt zich op 37 °C. Alles in deze plastic box is dus op 37 °C.

En direct boven op de objecttafel hebben we een mengsel van lucht en CO2. Dat is 5%CO2. Het idee is dus dat het monster zich feitelijk in een cel bevindt, vergelijkbaar met een celincubator.

En dus hebben we hier onze mengunit voor lucht en CO2, die bevochtigd en verwarmd wordt en vervolgens via leidingen naar het monster op de objecttafel wordt geleid. Oké. Vandaag gaan we alleen fluorescentie uitvoeren in één kanaal: GFP-fluorescentie. Dit is de slang waar de 5% CO2 doorheen gaat en deze past precies in de houder van de objecttafel.

Dat is belangrijk. Vervolgens kunnen we deze sluiten, ze weghalen en gaan we naar onze eerste positie. Ik begin bij het eerste gezichtsveld, mijn controlemonster, en ik kies de posities op basis van wat ik op het scherm zie.

Ik zorg er dus voor dat ik bij elke nieuwe well echt door de microscoop kijk, want het brandvlak voor elke well is anders; de schaal is aan de onderkant niet perfect vlak. U zult daarom kleine aanpassingen moeten maken wanneer u van de ene naar de andere well gaat. Ik ben nu bij de eerste well; wat ik ga doen is scherpstellen, dus ik heb zojuist het licht, het transmissielicht van de microscoop, ingeschakeld.

Vervolgens zorg ik ervoor dat al het licht naar de oculairs gaat. Ik kijk erin om te controleren of ik een helder en schoon beeldvlak heb. Daarna schakel ik dat licht uit, zet ik het fluorescentielicht aan en controleer ik of de cellen waarnaar ik kijk er gezond uitzien en niet apoptotisch zijn.

En, en dat zet ik uit. Wat ik daarna doe is verzenden, dus nu ga ik posities selecteren, wat betekent dat ik het lichtpad naar de camera moet sturen. Dit is de camera hier.

Ik stel de microscoop dus zo in dat het volledige signaal naar de camera gaat, waardoor er niets meer zichtbaar is door de oculairs. In de software die de microscoop aanstuurt, kies ik vervolgens de juiste filterset, wat voor onze doeleinden "psy" is, en stel ik een belichtingstijd in.

Ik ken deze cellen zeer goed en ik weet dat zij een belichtingstijd van 0,2 seconden vereisen. Daarom stel ik dit zo in in de software. Vervolgens zal ik op focus drukken.

Dit is het, en het is in feite gewoon levend. Er gaat een lampje aan en je kunt, oh, ik weet niet of je de cellen kunt zien, maar de reden waarom dit een goed gezichtsveld is, is omdat alle cellen, zelfs wat betreft hun fluorescentie, niet apoptotisch zijn. Apoptotische cellen zijn meestal erg helder en er zit geen vuil of onzuiverheden in het gezichtsveld.

En u kunt zien dat ze eigenlijk, dit is een metafasecel en dat is een metafasecel, en dat is een cel die waarschijnlijk net de mitose heeft verlaten. Dat kan ik zien omdat het lijkt alsof die twee sets chromatine zeer mooi ten opzichte van elkaar zijn georiënteerd, alsof ze net uit de anafase komen.

Dat is een goed gezichtsveld. Nu ik weet dat de belichtingstijd en de filterset correct zijn — en dit zal softwareafhankelijk zijn — zal ik posities vastleggen, zodat de software de X, Y, Z-positie van dat veld heeft onthouden. Wanneer ik vervolgens een ander veld kies, in hetzelfde putje, zal ik de sluiter openen en kijken wat ik op het scherm zie; ik kies de velden op basis daarvan in plaats van direct in het objectief te kijken.

Ik zie dus geen van mijn tonics daarin. Maar nogmaals, zelfs als ze mooi gecentreerd zijn, zullen deze cellen door mijn PS gaan; ik ga verder, hier is een goed voorbeeld. Dit is een goed voorbeeld van wat ik zou vermijden, zie je hoe helder dat is?

Dat is erg helder. Dat zijn waarschijnlijk resten van een apoptotische cel. De reden dat ik dat zou vermijden is dat de software, vanwege de hoge helderheid, bij het automatisch scherpstellen alleen op dat punt zal focussen, waardoor het niet in hetzelfde vlak komt te liggen als al deze andere cellen.

En dus zal ik geen informatie uit dat veld krijgen. Dat ziet er goed uit. Daar is een, dit is een pro-metafase hier, dat is een metafase.

Ik neem drie posities per put. Dat waren drie posities en nu ga ik naar de volgende put; ik zal waarschijnlijk elke 10 minuten beelden opnemen. Dat is een compromis.

Lifestyle-imaging is altijd een compromis, nietwaar? Je moet beelden vastleggen, maar tegelijkertijd de cellen gezond houden, vooral als je geïnteresseerd bent in mitose. Je moet daarom de blootstelling aan de fluorescente lijn minimaliseren.

Maar u wilt informatie verkrijgen. Daarom moet u beelden opnemen, dus u moet een compromis sluiten; u moet een keuze maken over wat u wilt vastleggen en welk soort informatie u wilt verkrijgen. Voor onze doeleinden duurt mitose doorgaans ongeveer een uur.

Als we intervallen van 10 minuten aanhouden, is dat best goed. We zien de profase, de metafase, de anafase, en we kunnen zien wanneer er behandelingen, geneesmiddelen of siRNAs zijn die deze specifieke stadia van de celcyclus beïnvloeden. Voor onze doeleinden is dat voldoende, maar we willen natuurlijk altijd meer.

We willen altijd meer posities, een fijnere tijd en een kleiner interval of iets dergelijks. Het is dus een compromis. Vervolgens klik ik op start.

Onze software voert bij de eerste doorloop een autofocus-procedure uit. Zodra ik op start druk, begint de automatische scherpstelling en ziet u de sluiter openen en sluiten tijdens het autofocusen. Ik druk nu op start.

Dit is het openen en sluiten van de sluiter. De Z-motor treedt in werking en probeert het vlak met het hoogste contrast te vinden, wat het vlak met de scherpste focus zal zijn. Je kunt op het scherm zien dat hij het beste focusvlak zoekt en weer verliest, wat zorgwekkend kan zijn.

Wat het systeem doet, is de Z-motor aansturen om het vlak met de beste focus, oftewel het scherpste beeld, te vinden. Vervolgens wordt daar een foto gemaakt en wordt die Z-positie opgeslagen. Deze Z-positie wordt daarna gebruikt voor de volgende 12 passes.

En daarna voeren we de autofocus-stap opnieuw uit. Wat voor soort experimenten doen ze? Oké, ons lab is vooral geïnteresseerd in het begrijpen van wat de mitotische progressie reguleert, of in ieder geval ben ik daar het meest in geïnteresseerd.

Met live-cell imaging en in het bijzonder ons multi-positie microscoop voor langetermijnbeeldvorming, kunt u cellen twee of drie dagen lang filmen terwijl ze de mitose ingaan en voltooien, en kunt u meerdere ronden van de mitose in beeld brengen om deze te begrijpen. Vervolgens kunt u geneesmiddelen, RNA's of andere soorten perturbaties toevoegen aan de cellen die u wilt bestuderen. Zo kunt u begrijpen hoe deze geneesmiddelen of genen een belangrijke rol spelen bij de regulatie van de mitotische progressie.

Omdat het niet gaat om werk met gefixeerde cellen maar om live-cell imaging, kunt u begrijpen wat er gebeurt, wanneer een perturbatie de mitose beïnvloedt of welke fase van de mitose wordt beïnvloed. In dat opzicht is het zeer krachtig. Wat zijn de belangrijkste technische elementen van deze experimenten?

Wat zijn de mogelijke problemen? Nou, het grootste probleem is, naast het opstellen van de installatie — wat overigens niet triviaal is — het zekerstellen dat deze goed functioneert voor uw specifieke toepassing.

Het financiële aspect is, weet u, niet klein. Er is enerzijds de opstelling van de apparatuur en zodra de gegevens zijn verzameld, is er daarna een aanzienlijke kwestie wat betreft de data-analyse. Het gaat om deze films; als u bijvoorbeeld 40 films verzamelt van elk 30 cellen, zodat u 40 velden heeft gefilmd en elk van die velden 30 cellen bevat, dan moet u bij elke film plaatsnemen en elke cel in die film bestuderen.

De data-analyse neemt dus erg veel tijd in beslag. Het duurt bijvoorbeeld een week om data te analyseren die je in twee dagen hebt verzameld. Dat is een aanzienlijk obstakel bij het verzamelen van grote hoeveelheden data.

Hoewel er sprake is van high-throughput datacollectie, is er dus geen sprake van high-throughput analyse. Wat zou u dan doen om dit experiment echt high-throughput te maken? Ons lab is momenteel bezig met de ontwikkeling van een programma dat de data-analyse automatisch uitvoert.

En het is een vrij degelijk programma. Het is niet perfect. Het menselijk oog is altijd beter, maar het komt in de buurt.

Wat zijn dan de interessante toepassingen van dit experiment? Zijn er wellicht andere vakgebieden die u kunt noemen? Naast celdeling?

Bedoelt u voor de, oh, voor de live-cell imaging? Ja. Nou, u kunt celmotiliteitsassays uitvoeren. Afhankelijk van de gebruikte microscopie kunt u, weet u, kijken naar hoe cellen zich gedragen; u zou bijvoorbeeld de tumorontwikkeling kunnen bestuderen als u dat zou willen.

Maar zolang u over de juiste imaging-opstelling beschikt, bent u vrijwel nergens door beperkt. Onze microscoop is toevallig een wide-field systeem en we gebruiken een 20x objectief. Het is dus een opstelling met een vrij lage resolutie, maar dat is voldoende voor wat we nodig hebben om te zien.

Er zijn er wel, maar er zijn er zeker geen die je zouden beperken. Alles wat een dynamisch type experiment bevat, wat bij biologie het geval is, zou echt profiteren van live-cell imaging. Zoals calcium-imaging; hoewel dat niet op onze apparatuur kan, is dat een live-cell methode.

Daarvoor is live-cell imaging absoluut noodzakelijk. Zoals ik al zei, patiëntenassays, motiliteitsassays en dat soort toepassingen zouden echt profiteren van live-cell imaging. Wilt u kort iets vertellen over uw eerdere ervaringen?

Hoe lang werkt u met deze technieken? Waar heeft u hiervoor aan gewerkt? Wauw. Tijdens mijn PhD heb ik hier niet aan gewerkt.

Ik heb veel ervaring met confocale microscopie, maar niet met live-cell imaging. Tijdens mijn postdoc heb ik dr. King dus geholpen bij het verkrijgen van deze apparatuur, die we gebruikten om deze fragmenten op te stellen en operationeel te krijgen. Tijdens mijn postdoc heb ik daarom veel ervaring opgedaan met zowel widefield time-lapse imaging op onze microscoop (de widefield) als met time-lapse imaging via confocale microscopie.

En ik zou zeggen dat het echt krachtig is. Je krijgt veel informatie, maar het is niet eenvoudig om het perfect werkend te krijgen. Het vereist dus echt veel aandacht en veel nauwkeurigheid bij elke kleine stap van het proces.

En zelfs dan heeft u nog steeds problemen. Het is dus een lastige toepassing, maar als het is wat u nodig heeft om uw wetenschappelijke probleem te bestuderen, dan is het in dat opzicht onschatbaar, maar het is zwaar. Zoek daarom iemand die weet wat hij doet en maak daar gebruik van.

Dat is mijn advies. Heel goed.