Name: Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Leer live-imaging van het ontwikkelende zebravisbrein met confocale microscopie op enkelcelniveau. Deze methode omvat mRNA-injectie in embryo's en het monteren voor hoogresolutiebeeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Veel dank aan Dr Jennifer Gutzman die als eerste deze techniek ontwikkeld in het Sive lab. Ook dank aan JB Green in het Dana-Farber Cancer Institute in Boston, MA, die zo vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor CAAX-GFP mRNA. De confocale imaging werd uitgevoerd op het WM Keck Foundation Biologische Imaging Facility bij de Whitehead. HS wordt ondersteund door NIHMH70926. EG wordt ondersteund door een NSF pre-doctorale beurs.

1. De voorbereiding van het mRNA voor injectie <ol><li> Het mRNA gebruikt in deze procedure is overgenomen uit een plasmide coderend voor CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. Eerst het plasmide lineariseren volgens Gutzman et al., 2008. </li><li> Dan transcriberen memGFP mRNA met behulp van de mMessage mMachine kit. </li><li> Verdun het resulterende mRNA naar 1μg/μl, aliquoot, en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Bereid een spuitgietmatrijs van 1% agarose met lanen de breedte van embryo&#39;s aan de ene cel podium. </li><li> Op de dag vóór injectie, opgericht paring kooien het scheiden van de man uit de vrouwtjes. </li><li> Op de dag van de injectie, trek capillaire naalden met behulp van een micropipet trekker voor te bereiden voor injectie. </li></ol> 2. Het injecteren van de mRNA <ol><li> Op de dag van de injectie, dooi een hoeveelheid van 1μg/μl memGFP mRNA op ijs. </li><li> Verdun het mRNA 01:05 in water tot een uiteindelijke concentratie van 200ng/μl, en blijf op ijs. </li><li> Laad de capillaire naald met 1μl geprepareerde memGFP mRNA op 200ng/μl. </li><li> Plaats geladen naald in een micromanipulator aangesloten op een gas-aangedreven microinjector. </li><li> Pas de injectie volume 1nl. </li><li> Trek de scheidslijn op wild-type vis opgericht in paring kooien van de vorige dag. </li><li> Het verzamelen van de embryo&#39;s zodra ze worden gelegd. Oriënteren ze in de agarose spuitgietmatrijs onder embryo medium (Westerfield, 1995) met de single cell aan de zijkant uit de buurt van de micromanipulator. </li><li> Injecteren via het chorion en de dooier zodanig dat de mRNA direct wordt gestort in het enkele cel. Injecteer ongeveer 50 embryo&#39;s per experiment. Niet injecteren als de cel heeft gedeeld. </li><li> Incubeer embryo&#39;s bij 28 ° C gedurende de nacht in embryo medium </li></ol> 3. Montage en Imaging embryo&#39;s <ol><li> Te monteren en het imago van de embryo&#39;s, verwijder de chorion met een tang uit de embryo&#39;s onder een stereomicroscoop een uur voor het tijdstip van belang. </li><li> Bereiden op een glijbaan voor montage tot en met 4 embryo&#39;s. <ul><li> Gebruik siliconen vacuüm vet aan op een dekglaasje zegel op de onderkant van een speciaal ontworpen 2mm dikke plastic glijbaan met een gat van ongeveer 1 cm in diameter. </li><li> Vul het gat in de dia met 0,7% agarose, en laat ongeveer 20 minuten of tot geharde </li><li> Nadat de agarose is gestold en verwijderen van een kleine stekker gebruikt 200μl pipet tips om cilindrische gaten in welke vorm aan elk embryo te monteren. </li></ul></li><li> Plaats de embryo&#39;s op de agarose gevulde schuif onder een dissectie microscoop. Voeg 50μl van tricaïne (Westerfield, 1995) om de embryo&#39;s verdoven. </li><li> Een tang om de embryo&#39;s positie in de cilindrische gaten in de agarose met de hersenen of de regio van belang tegen de onderliggende dekglaasje aan. </li><li> Bedek de embryo&#39;s in de agarose met een andere dekglaasje vastgezet met siliconen vacuüm vet. </li><li> Het imago van de embryo met behulp van een omgekeerde, TL-, laser-scanning of een draaiende schijf confocale microscoop. Beeld bij 63x of hoger nodig om hoge resolutie afbeeldingen van enkele cellen te verzamelen binnen de neuroepithelium. </li><li> Afbeeldingen worden geëxporteerd als TIFF-bestanden van de LSM-software en geanalyseerd met behulp van Photoshop. </li></ol> 4. Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat Weergegeven in figuur 1 is een representatief beeld van een confocale 24 HPF zebravis neuroepithelium tussen de middenhersenen en de achterhersenen ventrikels. Elke cel is voorzien van membraan-gebonden GFP. <img src="/files/ftp_upload/1217/Graeden JoVE figure 1.png" alt="" width="450" height="449" /> Figuur 1. Live-confocale beeldvorming van een memGFP-injectie 24 hpf zebravis embryo. (A) Neuroepithelium van een 24 HPF embryo met elke cel geschetst door GFP. Regio afgebeeld scheidt de middenhersenen en de achterhersenen ventrikels (M, H respectievelijk), de vorming van de middenhersenen-achterhersenen grens.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

In deze video tonen we een methode voor het mRNA injectie in een cel zebravis embryo&#39;s. Hier maken we gebruik van mRNA dat codeert voor een membraan-gerichte GFP aan elke cel label. Vervolgens hebben we laten zien hoe te monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen van enkele cel resolutie. Deze techniek heeft ons toegelaten om een ​​nieuw type van de cel van vorm veranderen, basale vernauwing, die nodig zijn voor de vorming van de middenhersenen-achterhersenen grens (Gutzman et al., 2008) te bestuderen....

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG agarose</td><td>Reagens</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoëzuurethylester (Tricaine)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire buisjes</td><td>Instrument</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0mmOD x 0,5mm ID/vezel 100mm</td></tr><tr><td>Siliconenvacuümvet</td><td>Reagens</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;l Pipetpunten</td><td>Instrument</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Dit is de juiste maat voor embryo's van 24 hpf. </td></tr><tr><td>mMessage mMachine transcriptiekit</td><td>Reagens</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA-polymerase</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 scanning confocale </td><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Instrument</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Instrument</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-trekker</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging van de zebravis embryonale brain door confocale microscopie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In deze video, tonen we de methode ons lab heeft zich ontwikkeld tot de cel verandert de vorm en de herschikkingen nodig zijn om te buigen en vouwen de zich ontwikkelende hersenen zebravis (Gutzman et al., 2008) te analyseren. Een dergelijke analyse biedt een nieuw begrip van de onderliggende celbiologie die nodig zijn voor de ontwikkeling van de 3D-structuur van de gewervelde hersenen en verhoogt ons vermogen om neurale buis morfogenese bestuderen. De embryonale zebravis hersenen gevormd wordt vanaf 18 uur na de bevruchting (HPF) als de hartkamers binnen de neuroepithelium te blazen. Door 24 HPF, de eerste stappen van de neurale buis morfogenese zijn voltooid. Met behulp van de hier beschreven methode, worden embryo&#39;s aan de ene cel stadium geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor membraan-gerichte groen fluorescerend eiwit (memGFP). Na injectie en incubatie, het embryo, nu tussen 18 en 24 HPF, is gemonteerd, omgekeerd, in beeld gebracht door agarose en confocale microscopie. Met name de zebravis embryo is doorzichtig, waardoor het een ideaal systeem voor fluorescerende beeldvorming. Terwijl onze analyses hebben zich geconcentreerd op de middenhersenen-achterhersenen grens en de achterhersenen, zou deze methode worden uitgebreid voor de analyse van elke regio in de zebravis op een diepte van 80-100 micrometer.

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo&#39;s bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

In deze video demonstreren we de methode die ons laboratorium heeft ontwikkeld om de veranderingen in celvorm en de herschikkingen te analyseren die nodig zijn om de ... te buigen en te vouwen.

Deze procedure begint met de injectie van een zebravisembryo in één-celstadium, dat in een injectiemal is geplaatst zodat de cel is georiënteerd met de zijde weg van het injectieapparaat. De embryo's worden vervolgens geïnjecteerd met MRNA, waarbij de naald door de dooier in de cel beweegt. De volgende dag.Een plastic objectglaasje wordt gevuld met aros. Een geanesthetiseerd embryo wordt vervolgens omgekeerd in een gat in de aros geplaatst en gevisualiseerd met confocale microscopie. Hoi, ik ben Grabham van het laboratorium van Dr. Hazel Sieve bij het Whitehead Institute for Biomedical Research en de afdeling biologie van MIT.Vandaag laten we u een procedure zien voor het injecteren van zebravissembryo's in het eencellige stadium en de daaropvolgende live-imaging van de hersenen via confocale microscopie. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om de morfogenese van de gewervelde hersenen op eencelige resolutie te bestuderen. Laten we beginnen.Het mRNA dat in deze procedure wordt gebruikt, wordt getranscribeerd vanuit een plasmide dat codeert voor C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A membraangebonden GFP. Lineariseer eerst het plasmide door digestie met not one, en transcribeer vervolgens

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer live-imaging van het ontwikkelende zebravisbrein met confocale microscopie op enkelcelniveau. Deze methode omvat mRNA-injectie in embryo's en het monteren voor hoogresolutiebeeldvorming.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Meer video's verkennen