Zebravis hersenventrikel Injection
6 april 2009
Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.
Deze procedure begint met het in scène zetten van zebravis-embryo's. Wanneer de embryo's het gewenste stadium hebben bereikt, verwijder ze dan uit het corion. Vervolgens worden er gaten gemaakt in een met aros gecoate schotel met een pipettip voor het monteren van de embryo's en worden de embryo's voorzichtig in de gaten geplaatst met hun staarten naar beneden.
Nadat de embryo's zijn gemonteerd, wordt een fluorescerende kleurstof voorzichtig geïnjecteerd in de ventrikelruimte van het embryo via de achterhersenen. Na injectie in de ventrikels, worden de embryo's geïmagerd en worden de gegevens verwerkt met behulp van Photoshop. Hallo, ik ben Jennifer Gutman van het laboratorium van Dr. Hazel Sieve aan het Whitehead Institute for Biomedical Research in MIT in Cambridge, Massachusetts.
Vandaag laten we je een procedure zien voor injectie van zebravis-hersenventrikels. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om hersenventrikelvorming en neuro-epitheliële morfogenese in levende zebravissen te bestuderen. Vanwege de aard van transparante zebravis-embryo's, kan het karakteriseren van de hersenventrikelvorm moeilijk zijn.
Deze techniek is een nuttige en eenvoudige manier om het met vloeistof gevulde gebied te onderscheiden van het omliggende weefsel en om mutante embryo's te karakteriseren die mogelijk hersenventrikelvormingsdefecten hebben. Dus laten we beginnen. Om de zebravis-hersenventrikel te injecteren, beginnen we met het maken van de injectienaalden.
Een Sutter-instrumenten naaldpool wordt gebruikt om de capillaire naalden te trekken. De capillaire naald wordt vervolgens gevuld met een fluorescerende kleurstof, zoals Texas red dextrine. Vervolgens wordt de gevulde naald gemonteerd in een micro-manipulator in een micro-injectie-apparaat.
Snij de naald op de juiste grootte onder een hoek. Om een afgeschuinde punt te maken, meet u de druppelgrootte van de naald en controleert u of deze tussen één en twee nanoliters per injectie in olie ligt. Om met deze procedure te beginnen, moeten de embryo's, volgens Kimmel et al, 30 minuten eerder worden geïnjecteerd dan het gewenste stadium.
Om bijvoorbeeld de ventrikels te bestuderen op 24 uur na bevruchting, injecteer je de embryo's op 23 en een half uur na bevruchting. Het embryo in het gewenste stadium wordt onder de stereomicroscoop geplaatst en het corion wordt voorzichtig van het embryo verwijderd met behulp van pincetten. Vervolgens wordt er een aros-schaal voor de embryo's gemaakt met behulp van een plastic schaal gecoat met 1% aros. Maak gaten in de aros met een plastic 1 tot 200 microliter pipettip.
Verwijder voorzichtig de aros-pluggen uit de gaten met behulp van pincetten. Breng het embryo en het embryomedium over in de aros-schaal met gaten. Voeg trica toe aan het medium om het embryo te verdoven en beweging te voorkomen.
Tijdens het experiment plaats je het embryo voorzichtig met de staart naar beneden in het gat en richt je het zo dat het injectieapparaat zich aan de achterste kant van het embryo bevindt. Nu het embryo correct is geplaatst en georiënteerd in de aros-schaal, zijn we klaar voor de hersenventrikelinjectie. Regel eerst de micro-manipulatie-instelling zodat de naaldpunt zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt als het embryo op hoge vergroting.
Breng de naald voorzichtig door de dunne dakplaat van de achterhersenen, net achter het R nul R één scharnierpunt zonder het hersenweefsel eronder te raken, injecteer net genoeg kleurstof om de ventrikels volledig te vullen. Het kan meerdere injecties duren om de ventrikelruimte te vullen, afhankelijk van het stadium van het embryo. Wanneer het embryo is geïnjecteerd en klaar is voor beeldvorming, wordt een nieuwe aros-schaal voor het embryo voorbereid.
Gebruik een schone met 1% aros gecoate schaal, maak gaten in de schaal en verwijder de pluggen. Breng het embryo over naar de schaal en voeg trica toe om het embryo te verdoven en beweging te voorkomen. Plaats de staart van het embryo met de geïnjecteerde ventrikel in het gat in positie voor een dorsale afbeelding.
Het embryo is nu klaar voor beeldvorming. Neem een afbeelding met behulp van doorgelaten licht. Het is erg belangrijk om het embryo of de microscoop niet te verplaatsen.
Verander vervolgens de instellingen op de microscoop en neem een afbeelding met fluorescentielicht. Positioneer het embryo opnieuw om zijdelingse afbeeldingen te maken met zowel doorgelaten licht als fluorescentielicht. Sla alle afbeeldingen op als bestanden voor beeldverwerking van Photoshop.
Om de afbeeldingen in Photoshop te verwerken, open je de doorgelaten licht- en fluorescentielichtafbeeldingen van hetzelfde embryo die op dezelfde positie zijn genomen. Zorg ervoor dat alle instellingen hetzelfde zijn. Sleep voor elke afbeelding je fluorescente afbeelding op de doorgelaten lichtafbeelding en lijn ze exact uit met de geselecteerde fluorescente afbeelding. Selecteer beeldaanpassingen en vervang vervolgens kleur en verander de zwarte achtergrond in wit.
In het venster Kleur vervangen, pas de wazigheidsfactor naar rechts aan totdat de fluorescente afbeelding uniform van kleur lijkt. Selecteer vermenigvuldigen in het lagenvenster. Om de overlay-afbeeldingen te bekijken, moet je ventrikelruimte-afbeelding exact overeenkomen met de doorgelaten lichtafbeelding.
Sla dit bestand op en herhaal dit voor eventuele andere afbeeldingen. Als de ventrikelinjectie correct wordt uitgevoerd, zouden de afbeeldingen scherpe randen moeten hebben in niet-diffuus kleurstof zoals hier getoond in deze afbeeldingen van 25 uur. Post fertilisatie terwijl type embryo's paneel A de heldere veldafbeelding toont, paneel B toont de fluorescente afbeelding en paneel C toont de overlay-afbeelding.
Een zijdelingse weergave van de overlay-afbeelding wordt getoond in paneel D.Aan de andere kant, als tijdens de ventrikelinjectie de naald te ver wordt ingebracht, zal deze het hersenweefsel onder de ventrikelruimte binnendringen en leiden tot een onjuiste injectie. Dit resulteert in kleurstof die zichtbaar is buiten de ventrikelruimte en in de dooier zoals hier getoond. paneel E toont de heldere
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek voor ventrikelinjectie in zebravisembryo's om de embryonale hersenventrikels te visualiseren. De methode verbetert het begrip van de neuroepitheliale vorm en vloeistofdynamica in levende embryo's.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Embryologie
Achtergrond
- Neuralbuisvorming is een kritisch proces in de embryonale ontwikkeling.
- Embryonaal hersenvocht (eCSF) speelt een rol bij de vorming van hersenventrikels.
- Het visualiseren van deze structuren in levende embryo's kan inzicht geven in ontwikkelingsprocessen.
- De ventrikelinjectietechniek maakt betere beeldvorming van deze structuren mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het injecteren van fluorescente kleurstof in de ventrikels van zebravisembryo's.
- Om de visualisatie van de vloeistofgevulde ruimtes in de embryonale hersenen te verbeteren.
- Om het begrip van neuroepitheliale dynamica tijdens de ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Staging van zebravisembryo's tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
- Embryo's monteren in een aros gecoate schaal met behulp van pipettentips.
- Injecteren van fluorescente kleurstof in de ventrikelruimte via de achterhersenen.
- Beeldvorming van embryo's na injectie en verwerking van gegevens met Photoshop.
Belangrijkste resultaten
- De ventrikelinjectietechniek visualiseert met succes de eCSF-gevulde ruimtes.
- Embryo's vertoonden duidelijke beeldvorming van neuroepitheliale vormen na injectie.
- De methode biedt een betrouwbare benadering voor het bestuderen van de embryonale hersenontwikkeling.
- Gegevensverwerkingstechnieken verbeteren de duidelijkheid van de beeldvormingsresultaten.
Conclusies
- De ventrikelinjectietechniek is effectief voor live beeldvorming van zebravisembryo's.
- Deze methode kan worden gebruikt om verschillende aspecten van neuro-ontwikkeling te bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van de effecten van genetische modificaties op de hersenontwikkeling omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing fluid-filled cavities in live embryos supports mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by clarifying structure-function relationships. This technique enables quantitative assessment of neuroepithelial dynamics, improving predictive confidence in early discovery. It aids in prioritizing genetic or pharmacological interventions based on phenotypic brain morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular morphology as a phenotypic readout for neuroepithelial shape changes.
- Operational Value: Provides a live-imaging compatible method to distinguish fluid spaces from tissue in transparent models.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking genetic perturbations to ventricular defects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescent and brightfield outputs for comparative analysis across conditions.
- Quantitative Output: Facilitates measurement of ventricle size and shape as dependent variables in screening campaigns.
- Reproducibility: Enables consistent ventricular labeling for cross-experiment comparison in multiwell formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved vertebrate brain ventricle formation, relevant to human neurodevelopmental disorder studies.
- Translational Continuity: Connects early neuroepithelial patterning to later brain structure and function.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in distinguishing primary ventricular defects from secondary tissue abnormalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening requires structural validation of fluid-filled compartments in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of ventricle formation dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantifiable ventricular morphology for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Provides image-based morphometric outputs that can be statistically compared across experimental groups.
- Translational Research: Links embryonic ventricle phenotypes to potential postnatal neurological outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental target and pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing phenotypic ambiguity in neurodevelopmental models.
- Operational Value: Standardizes ventricular labeling for reproducible imaging across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural phenotyping data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on brain morphogenesis safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microinjection techniques.
- Dependent on fluorescent dye compatibility and injection volume precision (1-2 nL).
- Necessitates standardized mounting and anesthesia protocols to prevent embryo movement during imaging.
- Requires image processing capability (e.g., Photoshop) for overlay and analysis of brightfield and fluorescent channels.
- Limited to embryonic and early larval stages due to increasing tissue opacity and ventricular accessibility.
