Zebravis hersenventrikel Injection

Deze procedure begint met het stadiëren van zebravisembryo's. Wanneer de embryo's het gewenste stadium hebben bereikt, worden ze uit het chorion verwijderd. Vervolgens worden er met een pipetpunt gaatjes gemaakt in een met Aros gecoate schaal om de embryo's te monteren, waarna de embryo's voorzichtig met de staart naar beneden in de gaatjes worden geplaatst.

Nadat de embryo's zijn gemonteerd, wordt er voorzichtig een fluorescerende kleurstof via de ruitenhersenen in de ventrikelruimte van het embryo geïnjecteerd. Na de ventrikelinjectie worden de embryo's afgebeeld en worden de gegevens verwerkt met Photoshop. Hallo, ik ben Jennifer Gutman van het laboratorium van Dr. Hazel Sieve aan het Whitehead Institute for Biomedical Research van MIT in Cambridge, Massachusetts.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het injecteren van de hersenventrikels bij zebravissen. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de vorming van de hersenventrikels en de neuro-epitheliale morfogenese in levende zebravissen te bestuderen. Vanwege de aard van transparante zebravissen-embryo's kan het karakteriseren van de vorm van de hersenventrikels lastig zijn.

Deze techniek is een nuttige en eenvoudige manier om de met vloeistof gevulde ruimte te onderscheiden van het omringende weefsel en om mutante embryo's te karakteriseren die mogelijk defecten in de vorming van de hersenventrikels hebben. Laten we beginnen. Om de injectie in de hersenventrikel van de zebravis voor te bereiden, beginnen we met het maken van de injectienaalden.

Een Sutter-instrument naaldtrekker wordt gebruikt om de capillaire naalden te trekken. De capillaire naald wordt vervolgens gevuld met een fluorescerende kleurstof, zoals Texas red dextrine. Daarna wordt de gevulde naald in een micromanipulator van een micro-injectieapparaat geplaatst.

Snijd de naald in een hoek op de juiste maat. Om een schuine punt te creëren, meet u de druppelgrootte van de naald en controleert u of deze tussen één en twee nanoliter per injectie in olie ligt. Om deze procedurefase te starten, moeten de embryo's, volgens Kimmel, bij alle embryo's 30 minuten vóór het stadium van belang worden geïnjecteerd.

Om bijvoorbeeld de ventrikels 24 uur na de bevruchting te bestuderen, worden de embryo's 23,5 uur na de bevruchting geïnjecteerd. Het embryo in het gewenste stadium wordt onder de stereomicroscoop geplaatst, waarna het chorion voorzichtig met een pincet van het embryo wordt verwijderd. Vervolgens wordt een aros-schaaltje voor de embryo's gemaakt met een plastic schaaltje gecoat met 1% aros; in het aros worden met een plastic 200 µL pipetpunt gaatjes geprikt.

Verwijder voorzichtig de aros-pluggen uit de gaten met een pincet. Breng het embryo en het embryomedium over naar de aros-schaal met gaten. Voeg trica toe aan het medium om het embryo te anesthetiseren en beweging te voorkomen.

Plaats tijdens het experiment het embryo voorzichtig met de staart naar beneden in het gat en oriënteer het zodanig dat het injectieapparaat zich aan de posterieure zijde van het embryo bevindt. Nu het embryo correct is geplaatst en georiënteerd in de agarschaal, zijn we klaar voor de injectie in de hersenventrikels. Richt eerst de micro-manipulatie-opstelling zo in dat de naaldpunt bij hoge vergroting in hetzelfde gezichtsveld als het embryo ligt.

Steek de naald voorzichtig door de dunne dakplaat van de achterhersenen, net posterior aan het R0-R1-scharnierpunt, zonder het onderliggende hersenweefsel te raken, en injecteer net genoeg kleurstof om de ventrikels volledig te vullen. Afhankelijk van het stadium van het embryo kunnen meerdere injecties nodig zijn om de ventrikelruimte te vullen. Wanneer het embryo is geïnjecteerd en klaar is voor beeldvorming, wordt een nieuwe agarose-schaal voor het embryo klaargemaakt.

Gebruik een schone, met 1%aros gecoate schaal, prik gaten in de schaal en verwijder de pluggen. Breng het embryo over naar de schaal en voeg trica toe om het embryo te anesthetiseren en beweging te voorkomen. Plaats de staart van het ventrikel-geïnjecteerde embryo in het gat in de positie voor een dorsaal beeld.

Het embryo is nu klaar voor beeldvorming. Maak een opname met behulp van transmissielicht. Het is van cruciaal belang dat het embryo of de microscoop niet wordt bewogen.

Pas vervolgens de instellingen van de microscoop aan en maak een afbeelding met fluorescent licht. Positioneer het embryo opnieuw om laterale afbeeldingen te maken met zowel doorgelaten licht als fluorescent licht. Sla alle afbeeldingen op als bestanden voor beeldbewerking in Photoshop.

Om de afbeeldingen in Photoshop te verwerken, opent u de doorgelet- en fluorescentieafbeeldingen van hetzelfde embryo die in dezelfde positie zijn genomen. Zorg ervoor dat alle instellingen identiek zijn. Sleep voor elke afbeelding de fluorescentieafbeelding over de doorgelet-afbeelding en lijn ze exact uit terwijl de fluorescentieafbeelding is geselecteerd. Selecteer beeldcorrecties, kies vervolgens voor kleur vervangen en wijzig de zwarte achtergrond in wit.

Pas in het venster 'Kleur vervangen' de factor 'fuzziness' naar rechts aan totdat de fluorescentieafbeelding een uniforme kleur heeft. Selecteer in het lagenvenster 'Vermenigvuldigen'. Om de overlay-afbeeldingen te bekijken, moet uw afbeelding van de ventrikelruimte exact overeenstemmen met de afbeelding van het doorgelaten licht.

Sla dit bestand op en herhaal dit voor alle andere afbeeldingen. Als de ventriculaire injectie correct is uitgevoerd, moeten de afbeeldingen scherpe randen vertonen in niet-diffuse kleurstof, zoals hier te zien is in deze afbeeldingen van 25 uur na bevruchting. In paneel A wordt de brightfield-afbeelding getoond, in paneel B de fluorescentie-afbeelding en in paneel C de overlay-afbeelding.

Een zijaanzicht van de overlay-afbeelding wordt getoond in Paneel D. Aan de andere kant, als de naald tijdens de ventriculaire injectie te ver wordt ingebracht, zal deze het hersenweefsel onder de ventriculaire ruimte binnendringen, wat leidt tot een incorrecte injectie. Dit resulteert in kleurstof die zichtbaar is buiten de ventriculaire ruimte en in de dooier, zoals hier getoond. Paneel E toont de bright field-afbeelding.

Paneel F toont de fluorescentieafbeelding en paneel G toont de overlay-afbeelding. Een lateraal aanzicht van de overlay-afbeelding wordt getoond in paneel H. De pijlen geven regio's aan waar de kleurstof buiten de hersenventrikelruimte is getreden. In deze video hebben we gedemonstreerd hoe fluorescerende kleurstof in de hersenventrikels van ontwikkelende zebravissen kan worden geïnjecteerd.

Deze methode wordt gebruikt om de ruimte van de hersenventrikels te visualiseren in contrast met het omringende neuro-epitheel, en is uiterst nuttig voor het bepalen van de vorm van de ventrikelruimte alsmede de vorm van het omringende hersenweefsel. Deze techniek stelt ons in staat om het proces van de vorming van de hersenventrikels en de hersenmorfogenese in het levende embryo in de loop van de tijd beter te begrijpen. Het is een uitstekend instrument voor het bestuderen van defecten bij de vorming van de hersenventrikels en voor de initiële karakterisering van mutanten voor hersenmorfogenese.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.