Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Deze procedure begint met het kweken van de bait-stam in media die normale aminozuren bevatten voor de SLAC-controlestam en zwaar isotopisch lysine en arginine. Gelijke hoeveelheden van beide stammen worden gemengd en gelyseerd door middel van malen en vloeibare stikstof. De ruwe lysaten worden eerst gepelletteerd via centrifugatie en vervolgens gezuiverd door binding aan spheros-beads. Het cellysaat wordt vervolgens gebonden aan IgG-beads.

De eiwitten die gebonden zijn aan IgG-beads worden geëluéerd met protease, gesplitst en geprecipiteerd. Het monster is nu klaar voor analyse via massaspectrometrie. Hallo, ik ben Jesse Chao van het Lone Lab in de afdeling Cell Environmental Biology van het Life Sciences Institute aan de University of British Columbia.

Vandaag tonen we u een procedure voor kwantitatieve proteomische analyse genaamd SILAC, gecombineerd met affiniteitszuivering. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om proteïnecomplexen te bestuderen.

Laten we beginnen. In deze procedure bevat de bait-stam normale aminozuren, terwijl de SLAC-controlestam zware isotopisch gelabelde lysine en arginine bevat. Om te beginnen kweekt u eerst van beide stammen, de bait-stam en de controlestam, afzonderlijk één liter tot de waarde die op uw scherm wordt weergegeven. Giet vervolgens de cultuur in Nalgene-centrifugebuizen van 500 milliliter.

Centrifugeer de cellen in pelletcellen bij 2.580 RCF, decanteer het medium en resuspendeer de pellet in 50 milliliters koud DH₂O terwijl u de cellen overbrengt naar centrifugebuizen van 50 milliliters. Centrifugeer de buizen om de cellen te pelletteren bij 3000 RCF. Op dit punt kunt u de pellet invriezen bij -80 °C.

Het is belangrijk om eraan te denken de controle-stamcultuur in een verhouding van één-op-één op basis van het droge pelletgewicht af te stemmen op de lokstamcultuur. Resuspendeer elk celpellet in 10 milliliters NP 40-buffer met een protease-remmercocktail in een verhouding van één op 2000. Meng de twee celculturen door de inhoud van de ene buis direct over die van de andere te gieten.

Om te beginnen met het vermalen van de cellen, giet eerst vloeibare stikstof in de vooraf gekoelde vijzel en laat dit volledig verdampen. Voeg vervolgens twee milliliters cellen toe aan de vijzel. Giet wat vloeibare stikstof over de cellen om deze te bevriezen.

Maal de cellen tot ze een fijn poeder worden. Herhaal dit proces tot alle cellen zijn gemalen. Zorg ervoor dat de cellen niet ontdooien.

Voeg indien nodig vloeibare stikstof toe. Breng het poeder vervolgens over naar een ijskoud bekerglas en laat het ontdooien bij kamertemperatuur. Zodra de randen beginnen ontdooien, voegt u 20 milliliters NP 40-buffer met een 1:200 PIC toe nadat het volledig is ontdooid.

Overbreng het ruwe lysaat naar 40 milliliter Nalgene-buisjes en centrifugeer deze op 16 000 RPM in een Sovos SA 600-rotor gedurende 30 minuten. Neem tijdens het wachten 300 microliters van de SROs twee B-beads en was de beads drie keer in 300 microliters NP 40-buffer. Resuspendeer de beads vervolgens in 300 microliters buffer zodat ze in een één-op-één slurry staan.

De volgende stap is het voorzuiveren van het cellysaat. Breng hiervoor eerst het supernatant over naar een nieuwe buis en voeg de Spheros two B-beads toe. Incubeer dit 30 minuten op een roteerplatform in een koude kamer.

Neem tijdens het incuberen 300 µL van de IgG SROs six beads en was de beads drie keer in 300 µL NP 40-buffer. Resuspendeer de beads vervolgens in 300 µL buffer, zodat er een slurry van één-op-één ontstaat. Pelleteer na incubatie de SROs.

Voeg twee beads toe. Overbreng het supernatant naar een nieuwe buis. Vergeet niet een aliquot van het cellysaat te bewaren voor latere western blotting.

Voeg vervolgens de IgG-beads toe. Verdeel de inhoud over twee buisjes voor een efficiëntere binding en incubeer dit twee uur lang op een roteerplatform in een koude kamer. Verzamel na de incubatie de beads in een chromatografiekolom bij vier graden Celsius.

Zorg ervoor dat er een aliquot van de ongebonden fractie wordt bewaard. Was de beads met 10 milliliters NP 40-buffer.

Was vervolgens de kralen met drie milliliter TEVC-buffer. Vergeet opnieuw niet om een aliquot van de kralen te bewaren.

Dit zal de efficiëntie van de binding weerspiegelen om de beads te elueren. Voeg eerst vijf µL A-C-T-E-V toe aan één mL TEVC-buffer. Voeg de TEVC-buffer toe aan de beads en meng.

Breng de inhoud over naar twee 1,5 milliliter EINOR-buisjes voor een efficiënter mengen en incubeer deze overnacht op een roteerplatform in een koude kamer. Centrifugeer vervolgens de beads en breng het eluaat over naar een nieuw 1,5 milliliter buisje. Was de beads daarna met nogmaals 0,5 milliliter TEVC-buffer.

Combineer de acht in één buis. In totaal moet u 1,5 milliliters van ELU acht hebben. Bewaar een aliquot van de TEV Elu acht voor precipitatie.

Pas de aliquots aan tot 25% TCA met honderd procent TCA. Verdeel hiervoor de 1,5 milliliter LU eight over twee buisjes van elk 750 microliters. Voeg 250 microliters 100% TCA toe aan het buisje.

Uw oplossing moet troebel worden. Plaats deze vervolgens gedurende 30 minuten op ijs. Vortex het mengsel periodiek na de incubatie.

Centrifuge 30 minuten op maximale snelheid in een tafelcentrifuge in een koelruimte. Was één keer met 500 µL ijskoud aceton dat 0,05 normaal zoutzuur bevat. Centrifugeer vervolgens vijf minuten op maximale snelheid bij 4 °C.

Was vervolgens één keer met 500 µL ijskoud aceton en centrifugeer vijf minuten op maximale snelheid bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het aceton en droog het pellet voor zilverkleuring. Resuspendeer het pellet in 50 µL van 1× SDS-monsterbuffer.

Als u van plan bent om het geprecipiteerde eiwit te gebruiken voor analyse via massaspectrometrie, wordt aanbevolen om ethanol voor de precipitatie te gebruiken. Voeg hiervoor eerst 20 micrograms glycogeen toe, verdun de monsters vervolgens vijf keer met honderd procent ethanol en stel in op 50 millimolar natriumbicarbonaat met een 2,5 molar voorraadoplossing bij pH 5,0. Meng de oplossing door de buis om te keren.

Laat dit twee uur bij kamertemperatuur staan. Verdeel vervolgens de inhoud over twee eppendorfbuisjes. Pelleteer het neergeslagen eiwit door 10 minuten te centrifugeren bij 12 000 g bij kamertemperatuur.

Het aliquot dat tijdens de zuiveringsprocedure wordt bewaard, moet het vooraf geklaarde cellysaat, de gebonden fractie, de ongebonden fractie en de geëlueerde fractie bevatten. We raden aan om de eiwitgehaltes van de bovenstaande aliquoten te analyseren via Western blotting met Antit TAP-antilichamen of via zilverkleuring om de bindings- en elutie-efficiëntie van het experiment weer te geven. In deze zilvergekleurde gel werden de gezuiverde SCS twee tap en de interactiepartners gevisualiseerd en vergeleken met een ongetagde controle in deze Western blot.

Verschillende fracties die tijdens de zuivering van SCS two tap zijn afgenomen, werden geanalyseerd via Western blotting met behulp van Antit tap-antilichamen. Let op dat SCS two tap migreerde naar een lager molecuulgewicht na elutie door TEV-protease splitsing, en dat er na elutie geen S SCS two tap meer op de IgG-beads aanwezig was. Dit bevestigde dat de zuivering zeer efficiënt was.

We hebben zojuist aangetoond hoe u proteïnecomplexen kunt zuiveren middels affiniteitszuivering met IgG-beads. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de basisstam en de controlestam op basis van het droge pelletgewicht gelijk te stellen voordat u met de zuiveringsprocedure begint. Aangezien LAC ons onbevooroordeelde en gekwantificeerde metingen van eiwitbindende partners verschaft, voeren we slechts de eerste fase van de TAP-zuivering uit om monsterverlies te minimaliseren.

Indien u veel aspecifieke binding ervaart, kunt u ervoor kiezen om het volledige protocol uit te voeren, welke te vinden is in de cold springing harbor handleiding. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Hé, kom op, Mark. Ah, ga maar.