Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae
March 4th, 2009
Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.
Deze procedure begint met het kweken van de lokaasstamf in media met normale aminozuren in de SLAC controlestam en zware isotopische lysine en arginine. Gelijke hoeveelheden van beide stammen worden gemengd en gelyseerd door te malen en vloeibare stikstof. Ruwe lysaten worden eerst gepelleteerd door centrifugatie en vervolgens geklaard door binding aan spheros-kralen. Het cellysaat wordt vervolgens gebonden aan IgG-kralen.
De aan IgG-kralen gebonden eiwitten worden afgesneden door protease, gekliefd en geprecipiteerd. Het monster is nu klaar voor analyse door massaspectrometrie. Hallo, ik ben Jesse Chao van de Lone Lab in het Departement van Cellulaire Milieubiologie aan het Life Sciences Institute van de Universiteit van British Columbia.
Vandaag laat ik u een procedure zien voor kwantitatieve proteomische analyse genaamd silak. Gecombineerd met affiniteitszuivering. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om eiwitcomplexen te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Bij deze procedure bevat de lokaasstamf normale aminozuren terwijl de SLAC controlestam zware isotopen, lysine en arginine bevat. Om te beginnen, kweek eerst elk een liter van de lokaasstamf en de controlestam apart tot de waarde die op uw scherm wordt weergegeven. Giet vervolgens het kweekmedium in 500 milliliter Nalgene centrifugeerbuisjes.
Balanseer de lading in de pelletcellen bij 2.580 RCF, decant het medium en resuspendeer de pellet. Met 50 milliliter koud D H2O terwijl u de cellen overbrengt naar 50 milliliter centrifugeerbuisjes, centrifugeert u de buisjes om de cellen bij 3000 RCF te pelleten. Op dit punt kunt u de pellet op negentig graden Celsius invriezen.
Het is belangrijk om te onthouden om de controlestamcultuur te matchen met de lokaasstamcuur in een-op-een door droog pelletgewicht. Resuspendeer elke celpellet in 10 milliliter NP 40-buffer met een een-op-2000 proteaseremmercocktail. Meng de twee celculturen door direct een buisje in de andere te decanteren.
Om te beginnen met het malen van de cellen, giet eerst vloeibare stikstof in de voorgekoelde mortel en laat deze volledig verdampen. Voeg vervolgens twee milliliter cellen toe aan de mortel. Giet wat vloeibare stikstof om de cellen te bevriezen.
Maal de cellen tot de cellen fijn zijn. Poeder. Herhaal het proces totdat alle cellen zijn gemalen. Zorg ervoor dat de cellen niet ontdooien.
Voeg wanneer nodig vloeibare stikstof toe. Breng vervolgens het poeder over naar een ijskou beker en laat het op kamertemperatuur ontdooien. Wanneer de randen beginnen te ontdooien, voegt u 20 milliliter NP 40-buffer toe met een een-op-200 PIC nadat het is ontdooid.
Breng het ruwe lysaal over naar 40 milliliter Nalgene-buisjes en centrifugeer bij 16.000 RPM in een Sovos SA 600-rotor gedurende 30 minuten. Terwijl u wacht, neemt u 300 microliters van de SROs twee B-kralen en wast u de kralen in 300 microliters NP 40-buffer drie keer. Resuspendeer vervolgens de kralen in 300 microliter buffers zodat ze zich in een een-op-een suspensie bevinden.
De volgende stap is om het cellysaat vooraf te klaren. Om dit te doen, brengt u eerst de super natin over naar een nieuw buisje en voegt u de Spheros twee B-kralen toe. Incubeer op een roterend platform in een koude kamer gedurende 30 minuten.
Tijdens het incuberen, neemt u 300 microliters van IgG SROs zes kralen en wast u de kralen in 300 microliters NP 40-buffer drie keer. Resuspendeer vervolgens de kralen in 300 microliter buffers zodat ze zich in een een-op-een suspensie bevinden. Na incubatie, pellet de SROs.
Twee be-kralen in. Breng het supernatant over naar een nieuw buisje. Vergeet niet om een aliquot van het cellysaat te bewaren voor western blotting later.
Voeg vervolgens de IgG-kralen toe. Scheid de inhoud in twee buisjes voor efficiëntere binding, incubeer op een roterend platform in een koude kamer gedurende twee uur. Na incubatie, verzamel de kralen in een chromatografiekolom bij vier graden Celsius.
Zorg ervoor dat u een aliquot van de ongebonden factie bewaart. Was de kralen met 10 milliliter. NP 40-buffer.
Was vervolgens de kralen met drie milliliter. TEVC-buffer. Vergeet weer niet om een aliquot van de kralen te bewaren.
Dit weerspiegelt de bindingsefficiëntie om de kralen te elueren. Voeg eerst vijf microliters van A-C-T-E-V toe aan één milliliter TEVC-buffer. Voeg TEVC-buffer toe aan de kralen en meng.
Breng de inhoud over in twee 1,5 milliliter EINOR-buisjes voor efficiënter mengen en incubeer op een roterend platform in een koude kamer overnacht. Draai vervolgens de kralen neer en breng het eluaat over in een nieuw 1,5 milliliter buisje. Was de kralen na het wassen met extra 0,5 milliliter TEVC-buffer.
Combineer de acht in één buisje. U zou in totaal 1,5 milliliter ELU acht moeten hebben. Bewaar een aliquot van de TEV Elu acht om te precipiteren.
Pas de aliquoten aan op 25% TCA met honderd procent TCA. Om dit te doen, scheidt u de 1,5 milliliter LU acht in twee buisjes van 750 microliters elk. Voeg 250 microliters van 100% TCA toe aan het buisje.
Uw oplossing zou melkachtig moeten worden. Plaats het vervolgens 30 minuten op ijs. Periodiek vortex de mix na incubatie.
Centrifugeer bij maximale snelheid in de tafelcentrifuge in een koude kamer gedurende 30 minuten. Was eenmaal met 500 microliters ijskou aceton met 0,05 normaal zoutzuur. Draai vervolgens vijf minuten bij maximale snelheid bij vier graden Celsius.
Was vervolgens eenmaal met 500 microliters ijskou aceton en draai vijf minuten bij maximale snelheid bij vier graden Celsius. Na het draaien, verwijdert u voorzichtig het aceton en droogt u de pellet voor zilverkleuring. Resuspendeer de pellet in 50 microliters van eenmaal de SDS-monsterbuffer.
Als u van plan
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een kwantitatieve proteomicstechniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. De studie gebruikt de SILAC-methode in combinatie met affiniteitszuivering en tandem massaspectrometrie om de bindingspartners van het ER-eiwit Scs2p te bepalen.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Celbiologie
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het verduidelijken van cellulaire functies.
- SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture) is een krachtige methode voor kwantitatieve proteomics.
- Affiniteitszuiveringstechnieken verhogen de specificiteit van eiwitcomplexidentificatie.
- Tandem massaspectrometrie maakt een gedetailleerde analyse van eiwitinteracties mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een robuuste methode te ontwikkelen voor het identificeren van eiwitcomplexen in gist.
- Om de bindingspartners van het ER-eiwit Scs2p te onderzoeken.
- Om de specificiteit en gevoeligheid van proteomische analyses te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kweek van lokkaasstammen in media met normale en zware isotopen van aminozuren.
- Mengen en lyseren van stammen om ruwe lysaten te verkrijgen.
- Opruimen van lysaten met spheros-kralen en binding aan IgG-kralen.
- Elueren van eiwitten van IgG-kralen voor massaspectrometrieanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van Scs2p-bindingspartners.
- Demonstratie van de effectiviteit van de SILAC-methode in proteomics.
- Hoge specificiteit bereikt bij de identificatie van eiwitcomplexen.
- Inzichten in de rol van Scs2p in cellulaire processen.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek verbetert het begrip van eiwitinteracties in gist.
- De bevindingen dragen bij aan het bredere veld van proteomics en celbiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere organismen en eiwitcomplexen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative proteomics enables unbiased identification of protein interaction networks, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By distinguishing specific binding partners from contaminants through isotopic labeling, the method enhances predictive confidence in protein complex analysis. This approach addresses a key challenge in studying membrane contact sites and lipid trafficking mechanisms relevant to cellular signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein-protein interactions at ER-PM membrane contact sites.
- Operational Value: Reduces false positives through SILAC-based quantification, improving target validation reliability.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the molecular composition of lipid trafficking complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining the protein composition of ER-PM MCSs.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative interaction data suitable for assay standardization and scalability.
- Scientific Value: Facilitates preparation of disease-relevant models by identifying conserved eukaryotic proteins involved in lipid signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into lipid trafficking and signaling, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through reproducible complex identification across experimental replicates.
- Scientific Value: Supports preclinical model development by defining conserved protein complexes in yeast applicable to higher eukaryotes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative interaction data that informs target prioritization and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying Scs2p interaction partners in lipid trafficking networks.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein interaction profiles with quantitative readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Enables condition comparison through SILAC-based quantification, allowing teams to distinguish specific binding from background noise.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying conserved eukaryotic proteins involved in membrane contact site function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics platform for studying protein complexes across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized SILAC labeling and affinity purification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative interaction data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction network confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative proteomics, mass spectrometry, and yeast culture techniques.
- Depends on instrumentation for SILAC labeling, affinity purification, and high-resolution LC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, lysis protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-yeast model systems or alternative lysis conditions.
- Includes practical limitations related to the dynamic range of detection and the need for high-abundance bait expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:45
Introduction
1:17
Preparation of the Bait and SILAC Control Strain
2:44
Grinding of Cells
4:05
Pre-clearing Cell Lysate
5:51
Eluting From IgG Beads by TEV Protease Cleavage
6:45
Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation
9:00
Sample Analysis by Western Blotting and/ or Silver Staining
8:11
EtOH/ Acetate Precipitation
9:30
Representative Results/ Outcome
10:15
Conclusion
