Name: Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Leer calciumbeeldvorming in glad spierweefsel van geïsoleerde organen met confocale microscopie. Deze methode analyseert neurotransmittereffecten en calciumsignalering voor fysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De Wellcome Trust heeft financiële steun verleend (VIP Award uit aan JSY en 074.128 Research Fellowship aan KLB). Medical Research Council studententijd aan RJA Leica_SP2_Stacker, een algoritme gebruikt om de TIFF&#39;s importeren voor &#39;reconstructie&#39; in een reeks, is gebaseerd op Leica_tiff_sequence, een plugin voor het lezen van Leica SP2 TIFF&#39;s in ImageJ, ontwikkeld door Tony Collins en gebruikt met zijn toestemming. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg en TurboReg, zijn algoritmen die worden gebruikt om te corrigeren voor verplaatsing van weefsel, op basis van Th venaz en collega&#39;s (1998) 9. Excel_writer.jar werd geschreven door Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, het deeltje detectie-algoritme, is gebaseerd op een algoritme geschreven door KL Brain en eerder vijf gedetailleerd.

Deel 1: Voorbereiding van de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 wordt geleverd AM in 500 pi flacons als een kleine hoeveelheid (50 ug) van poeder. Voeg 40 ul Pluronic F-127 oplossing voor het poeder, schudden zachtjes gedurende 30 s, voeg dan 460 ul PSS, en schud voorzichtig gedurende 30 s. De uiteindelijke oplossing, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, geeft 4 x 125 ul aliquots. Vermijd blootstelling aan licht en op te slaan bij -20 C. </li></ol> Deel 2: Ca 2 + geladen <ol><li> Verwijder de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) van de (-20 C) diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur. </li><li> Neem 1 ml van PSS in een reageerbuis en plaats in het water-bad. Bubble met 95% O 2 / 5% CO 2 met een snelheid van ongeveer 1 bubble verschijnen per seconde. De bubbler dient te worden bevestigd in de test-buis, bijv. met een stop of met Parafilm. </li><li> Ontleden het weefsel van het dier, en in een Sylgard gevoerde petrischaal, verwijder voorzichtig bindweefsel. Onafhankelijk van de gladde spieren orgel type, moet PSS vervangen worden elke 10 minuten en weefsel moet goed worden gewassen (bijvoorbeeld door het vervangen van de PSS drie keer) na dissectie. Voor de zaadleider: denk aan het snijden van het orgel lengte manieren om een ​​blad van het weefsel te produceren. Voor de urineblaas: open lengterichting van de blaashals (posterior) naar de top van de koepel (anterior). Bereiden vier strips, 6 - 8 mm lang en 1 - 2 mm breed, langs het dorsale oppervlak van de detrusor, het snijden in de richting van de dominante spier bundels. </li><li> Plaats ontleed weefsel in de &#39;pre-verwarmd en borrelde&#39; PSS. </li><li> Voeg 125 ul van 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM om de test-tube en geef een beetje schudden, met de hand, om te mengen. </li><li> CV borrelen en laat, afgedekt met folie. De tijd is duurt voor voldoende weefsel te maken van de Ca 2 +-indicator varieert met de grootte van weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Bijvoorbeeld: 70 minuten (muis detrusor, rat anococcygeus) tot 120 min. (rat detrusor, muis vas deferens). </li></ol> Deel 3: Voorbereiden van de &#39;Ca 2 + geladen&#39; weefsel voor microscopie Zorgvuldige pinning van het weefsel is nodig om spontane beweging van het weefsel (een eigenschap van de beeldvorming van de gladde spiercellen van relatief intact weefsel) te minimaliseren en om de locatie van een geschikte plaats voor de beeldvorming (als een plat stukje weefsel kan vergemakkelijken onderzocht in twee dimensies, in plaats van drie). <ol><li> Spoel het weefsel in borrelde PSS gedurende minstens 5 minuten. </li><li> Mount in Sylgard gevoerde voorbereiding gerecht, dat zich uitstrekt van het weefsel (licht) om een ​​vlakke plaat te vormen. Vermijd het gebruik van lange &#39;pinnen&#39; dat het doel kan krassen, te gebruiken in plaats korte lengtes van 25-50 micrometer diameter zilverdraad als &#39;pinnen&#39; en invoegen op een hoek. </li><li> Plaats de schotel voorbereiding op de microscoop podium, zorg ervoor te zorgen dat de PSS niet ontsnappen aan de Sylgard omzoomde gebied van de schotel (omdat dit kan leiden tot een groot gebied worden behandeld in PSS, toen de superfusie begint). </li><li> Schakel de pomp in om de voorbereiding superfuse met PSS. Een tarief van 100 ml per uur wordt vaak gebruikt. </li><li> Schakel de verwarming unit. </li><li> Plaats de in-en uitstroom buizen en temperatuursonde aan de voorbereiding schaal (het aanbrengen van elk van de metalen strip door de magneet op zijn basis). De hoogte van de tip van de uitstroom buis bepaalt de diepte van de PSS. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de uitstroom in feite is het verwijderen van PSS (omdat het soms niet in eerste instantie). </li><li> Stel de temperatuur op de kachel unit op de gewenste temperatuur, bijvoorbeeld 33 tot 35 C. te bereiken </li><li> Laat het weefsel in evenwicht gedurende minstens 10 minuten. </li></ol> Deel 4: Keuze van de site om de afbeelding Blootstelling aan excitatie verlichting zal de indicator photobleach, dus vermijd het gebruik van voor meer dan een paar seconden per keer. <ol><li> Met een laag vermogen doelstelling (10x of 20x) gebruik epifluorescentie, spannend met een blauw licht, om de gladde spieren te bekijken en een geschikte regio om toezicht te houden identificeren. Probeer een site op basis van pick: beweging (dat moet minimaal zijn) en het aantal van gladde spiercellen in het veld. Bright &quot;structuren&quot; kan een groot aantal &#39;false positives&#39; in het beeld detectiealgoritme veroorzaken, dus vermijd sites met grote aantallen (bijvoorbeeld) afgewisseld epitheliale cellen of fibroblasten. </li><li> Schakel over naar een hogere macht doelstelling (40x). </li><li> Draai het podium of de optische as, zodat de gladde spiercellen (s) ligt horizontale (dat wil zeggen parallel aan de snelle scan as). </li></ol> Deel 5: confocale microscopie De details van hoe de confocale microscoop is &#39;set up&#39; zijn specifiek voor elke microscoop type, maarde belangrijkste overwegingen zijn: snelheid (minimaal 5 Hz is vereist voor de meeste Ca 2 + overgangen), resolutie en grootte van het veld (die beide worden verhandeld-off met snelheid). Sommige van de volgende protocol is specifiek voor een Leica SP2 rechtop confocale microscoop. Een typische protocol is: 100 beeld-serie, verwierf op 5 Hz (256 x 256 pixels; ca. 100 x 100 micrometer.) Of 13,5 Hz (256 x 64 pixels, ca. 100 x 25 pm.). Het scannen kop ingesteld op bi-directioneel te verplaatsen (de verwerving snelheid te maximaliseren) en bij 1000 Hz per regel te verwerven. <ol><li> Sluit het gaatje om een ​​&#39;luchtige disk&#39;. </li><li> Stel de laser (488 nm) de macht tussen de 25 en 35% op de AOTF: deze waarde wordt een trade-off tussen helderheid en fotobleking. (De laatste is vooral een probleem bij lange opnamen.) </li><li> Verwerven zes series per site, en vier - zes vestigingen per &#39;behandeling&#39;. Is het gebruikelijk om te streven naar dezelfde zes sites pre-drug (dat wil zeggen &#39;control&#39;) en post-drug monitor, hoewel ook hier belangrijke fotobleken kan de experimentator af te wijken van dit. </li><li> Het is essentieel met Ca 2 + imaging dat de &#39;time controls&#39; worden uitgevoerd. </li></ol> Deel 6: Voorbereiding voor de analyse <ol><li> Download en installeer Image J uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Download de platform-specifieke versie, en dan updaten naar de nieuwste versie van downloaden van de nieuwste imageJ.jar bestand van http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, ter vervanging van het oude bestand. Apple Mac-gebruikers: als het werkt langzaam, zorg ervoor dat je de laatste versie van de Java Virtual Machine (JVM), verkrijgbaar bij Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) gebruikt. </li><li> Download Excel_writer.jar uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html en installeren in de Plugins [directory]&gt; jar directory. </li><li> Kopieer de volgende bestanden in de plugins directory: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installeer elk van deze scripts met de Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Install ... functie van ImageJ. </li><li> We maken gebruik van een Leica SP2 confocale microscoop, de software (Leica LCS) waarvoor elke serie genereert als een zichtbaar &#39;movie&#39; binnen de software, maar bespaart als individuele frames. Te reconstrueren frames in de serie: (i) Zorg ervoor dat alle &#39;frames&#39; om gereconstrueerd te worden in een map (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&gt; Tiffs&#39;). (Ii) Selecteer Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Leica_SP2_Stacker. Selecteer de root directory (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&#39;). Selecteer de gewenste map in de drop-down lijst (bijvoorbeeld &#39;Tiffs /&#39;). Selecteer een output directory of het genereren van een nieuwe (bijvoorbeeld &#39;DataFolder&gt; Stacks&#39;). Het script zal dan te reconstrueren series van individuele frames. </li></ol> Deel 7: Correctie voor beweging Hoewel beweging van de website afgebeeld kan worden geminimaliseerd met goede pinning en gelijkmatig-uitgerekt weefsel, sommige gladde spieren organen vertonen spontane weeën die niet kan worden opgeheven door een zorgvuldige pinnen alleen. Hier beschrijven we het gebruik van een vrij beschikbare algoritme dat aansluit of overeenkomt met frames in een serie. <ol><li> Download &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) en &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installeer elk in de Plugins map met behulp van de Plugins&gt; Macro&#39;s&gt; installeren ... </li><li> Plaats een stapel om te worden verwerkt (File&gt; Open ...) en vervolgens naar een frame dat duidelijk laat zien op het gebied van belang. Andere frames zullen worden afgestemd op dit referentiekader. </li><li> Plugins&gt; Stacks&gt; StackReg. Probeer elk van de verschillende &#39;Transformaties&#39; (dat wil zeggen Translation, Rigid Body, Geschaalde Rotation, Affine) om te bepalen wat het meest effectief is. (Meer informatie: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Deel 8: Particle detectie-algoritme Voor elke &#39;site&#39; belicht, zullen factoren variëren dat van invloed op de detectie van Ca 2 + transiënten. Door het meten van bepaalde eigenschappen van elke site (&#39;particle parameters&#39; - hieronder), is het proces van opsporing vergemakkelijkt. Dus voor elke site, een berekent &#39;drempel voor aftrek&#39;, &#39;drempel voor-ratio&#39; en &#39;cell edge drempel&#39;. <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; Install ... en selecteer &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macro&#39;s&gt; belasting stack (sneltoets: l). Kies een serie en bereken deeltje parameters: <ol style="list-style:none;"><li> a. Drempel voor afgetrokken (= achtergrond) </li></ol></li><li> Selecteer een rechthoekige ROI over wat je geloven &#39;achtergrond&#39; te zijn. </li><li> Measure (sneltoets: m). Noteer MEAN. <ol style="list-style:none;"><li> b. Berekening van de drempel voor verhouding </li></ol></li><li> Selecteer een rechthoekigeROI rond een optisch vlakke oppervlakte van de cel (len). </li><li> Measure (sneltoets: m). Noteer gemiddelde en de standaarddeviatie. </li><li> Herhaal nog eens twee keer of je kunt tekenen drie dozen in een keer door op &#39;shift&#39;. </li><li> Berekenen en naar beneden drempel voor-ratio note = (1 + SD / gemiddelde) x 32, met een gemiddelde waarde van de drie herhalingen / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Cel rand drempel </li></ol></li><li> Afbeelding&gt; Stacks&gt; Z project ... Kies een projectie type: &#39;gemiddelde intensiteit&#39; </li><li> Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Drempel. </li><li> Selecteer zwart en wit. </li><li> Definieer &#39;onder&#39; (bovenste slider) te beperken en noteer de overeenkomstige waarde (aan de rechterkant van de slider). Alleen gebeurtenissen die zich in de zwarte regio&#39;s zullen worden geteld. </li><li> Klik op &#39;reset&#39;. </li><li> Analyse stacks (sneltoets: 2) </li><li> Selecteer gewoon een serie in dit stadium, dat wil zeggen de &#39;eerste file&#39; en &#39;laatste bestand&#39; moet hetzelfde zijn. </li><li> Voer waarden van de &#39;drempel voor aftrek&#39;, &#39;drempel voor-ratio&#39; en &#39;cell edge drempel&#39;. Laat andere instellingen op hun standaardwaarden. </li><li> Het algoritme zal een dual-ruit venster waarin de verwerkte serie wordt weergegeven op de linker-en het origineel aan de rechterkant. Zorgvuldig gaan door dit om het aantal valse positieven en de keren dat gebeurtenissen, zichtbaar op het oog, niet zijn ontdekt beoordelen. Om een meer nauwkeurige detectie van Ca 2 + transiënten kan het nodig zijn om iets aan te passen een aantal van de &#39;particle parameters&#39;. Terwijl het proces kan een beetje &#39;hit and miss&#39; lijkt bij de eerste poging, krijgt men al snel een gevoel van wat parameters centraal staan. </li><li> Voor elke serie, het algoritme produceert een Excel-bestand dat details de kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis (zoals amplitude, ruimte en positie). &#39;False positives&#39; - geïdentificeerd door de herziening van de image-bestanden die het algoritme uitgangen (bijv. stap 8.17) - kunnen worden verwijderd, met de hand van dit Excel-bestand. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Pogingen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren; alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 en de Europese Gemeenschappen van Richtlijn 86/09/EEC.

Keuze uit fluorescerende Ca 2 +-indicator Oregon Green 488 BAPTA-1 AM werd gekozen als de Ca 2 +-indicator, omdat het (i) is licht in vergelijking met andere indicatoren (bijv. Fluo-4 en Calcium Groen) 1, (ii) is gevoelig voor fysiologische veranderingen in Ca 2 +-concentratie met een K D van dezelfde orde van grootte 1 op de intracellulaire Ca 2 +-concentratie [Ca 2 +] i (bijvoorbeeld van vas deferens 2), (iii) laadt een groot aantal gladde spiercellen, waardoor gladde spiercellen koppeling te worden gecontroleerd. Echter, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM is een non-ratioable Ca 2 +-indicator, en als zodanig niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de absolute bepalen [Ca 2 +] i. Bovendien kan het ook buffer Ca 2 + indien aanwezig in hoge concentraties en wordt verzadigd met een hoge amplitude veranderingen in [Ca 2 +] i. Remming van spontane contractiliteit De spontane contractiliteit van de gladde spieren organen kunnen farmacologisch worden verminderd, bijvoorbeeld door het blokkeren van de beweging van Ca 2 + door de L-type Ca 2 +-kanalen (bijv. door: nifedipine 3; diltiazem 4). Merk op dat deze medicijnen sterk zal de amplitude van whole-cell Ca 2 + flitsen / transiënten te verminderen. Contractie van de zaadleider resultaat van een combinatie van voornamelijk purinerge en noradrenerge neurotransmissie. Focus Ca 2 + transiënten in dit weefsel zijn echter ongevoelig voor noradrenerge receptor blokkade (bijv. α een adrenoceptor, door prazosine 5), zodat beweging kan worden verlaagd zonder dat dit invloed focale Ca 2 + transiënten. Als alternatief kan samentrekking worden voorkomen &#39;downstream&#39; door de remming van myosine lichte keten kinase, bijvoorbeeld door wortmannin 6. Conclusies Monitoring Ca 2 + fluorescentie bij submicron resolutie is een krachtige techniek om de post-junctionele effecten van neurotransmitters 5,7 bestuderen en het vrijkomen van Ca 2 + uit interne winkels (bijvoorbeeld &#39;vonken&#39; 8). De analyse van Ca 2 + transiënten het gebruik van de beschreven methode is hier rendabel in vergelijking met commercieel verkrijgbare beeldanalyse pakketten en maakt het mogelijk op maat gemaakte analyse door middel van op maat geschreven Java-plug-ins voor ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>20% oplossing in DMSO</td></tr><tr><td>Leica SP2 rechtopstaande confocale microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luchttafel (&amp;#8216;trillingsgeïsoleerd werkstation&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomeer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

focus ca 2 + voorbijgaande detectie in glad spierweefsel

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + beeldvorming van het gladde spierweefsel geeft inzicht in cellulaire mechanismen die niet kan resulteren in veranderingen van de membraanpotentiaal, zoals de vrijlating van Ca 2 + van interne winkels, en maakt het mogelijk meerdere cellen tegelijkertijd worden gecontroleerd om, te beoordelen bijvoorbeeld, koppeling in syncytieel weefsel. Subcellulaire Ca 2 + transiënten komen vaak voor in de gladde spieren, maar zijn moeilijk nauwkeurig te meten, vanwege de problemen veroorzaakt door hun stochastische gebeurtenis, dan een vaak breed gezichtsveld, in een orgaan dat het gevoelig zijn voor contract. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een serie van beeldvorming protocollen en analyse routines om vervolgens te verwerven en te analyseren, op een geautomatiseerde manier, de frequentie, de locatie en de amplitude van dergelijke gebeurtenissen. Hoewel deze aanpak kan worden toegepast in een andere context, onze eigen werk bestaat uit het opsporen van de lokale purinerge Ca 2 + transiënten voor het lokaliseren van de zender release met submicron-resolutie. ATP is uitgebracht als een cotransmitter van de autonome zenuwen, waar het bindt aan P2X1 receptoren op de gladde spieren van de detrusor en de zaadleider. Ca 2 + komt in de gladde spieren, wat resulteert in purinerge neuroeffector Ca 2 + transiënten (NCTS). Het brandpunt Ca 2 + transiënten kan de optische controle van de neurotransmitters in een manier die veel voordelen ten opzichte van elektrofysiologie heeft. Afgezien van de sterk verbeterde ruimtelijke resolutie, optische recording heeft het extra voordeel dat de opname van de zender vrijlating uit een groot aantal te onderscheiden locaties tegelijk. Bovendien is de optische vlak van focus is makkelijker te onderhouden of te corrigeren tijdens de lange opname-serie dan is de herpositionering van een intracellulaire scherp micro-elektrode. Samengevat, is een methode voor de beeldvorming van Ca 2 + fluorescentie geschetst waarin de details van de voorbereiding van de weefsel, en de verwerving en analyse van gegevens. Schetsen we het gebruik van meerdere scripts voor de analyse van dergelijke Ca 2 + transiënten.

Details methoden voor hoge-resolutie Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Beeldvorming van het gladde spierweefsel in geïsoleerde organen, zoals: de voorbereiding van het weefsel, beeld-acquisitie en data-analyse.

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Ca2+-imaging van glad spierweefsel biedt inzicht in cellulaire mechanismen die mogelijk niet leiden tot veranderingen in het membraanpotentiaal, zoals de afgifte van Ca2+ ...

Eerst wordt een calciumlaadoplossing bereid, opgewarmd en belucht. De urinablaas wordt gedissecteerd, geopend, platgepind en er wordt een strook detrusor afgenomen. De detrusorstrook wordt toegevoegd aan de laadoplossing, geïncubeerd, gespoeld en platgepind.De calciumfluor binnen het weefsel wordt geëxciteerd door laserlicht en het geëmitteerde licht wordt vastgelegd. Films bestaande uit individuele frames worden geanalyseerd door opeenvolgende frames met elkaar te vergelijken. De achtergrond wordt afgetrokken.De drempelwaarde voor de celrand bepaalt waar events kunnen worden gevonden en er wordt een ratio tussen opeenvolgende hersenen berekend. Als de resterende events voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria, worden ze gemarkeerd en gelabeld. Hallo, mijn naam is John Young van de laboratoria van Keith Brain en Tom Kinane op de afdeling Farmacologie van de universiteit van Oxford.Ik ben Rob Amos, evenals Keith Brain, beiden van de Brain- en Canne-labs. Vandaag zullen John en Rob u een calcium-imagingtechniek in glad spierweefsel laten zien. We gebruiken dit in ons laboratorium om de afgifte van neurotransmitters uit autonome zenuwen en het effect daarvan op glad spierweefsel te bestuderen.Laten we beginnen. De calciumindicator Organ Green 488 BAPTA-1 wordt geleverd in vials van 500 µL die 50 µg poeder bevatten. Om de calciumindicator te bereiden, voegt u 40 µL ONIC F1 27-oplossing toe aan het poeder en schudt u dit gedurende 30 seconden voorzichtig. Voeg daarna 460 µL fysiologische zoutoplossing (PSS) toe en schud nogmaals 30 seconden voorzichtig.De uiteindelijke oplossing, 10 µM Organ Green 488 BAFTA, levert vier aliquots van elk 125 µL op. Vermijd blootstelling aan licht en bewaar de oplossing bij -20 °C voorafgaand aan het dissekeren van het betreffende weefsel.Haal de calciumindicator uit de vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur terwijl de calciumindicator ontdooit. Plaats één milliliter PSS in een reageerbuis en in een waterbad op 33 °C. Bevestig een borstelaar in de reageerbuis met een stop, of u kunt ook Parafilm gebruiken, en borrel vervolgens met een mengsel van 95% oxygen en 5% carbon dioxide met een snelheid van ongeveer één bel per seconde.Dissekeer het gladspierorgaan uit het dier. In dit geval betreft dit de urineblaas van een muis. Plaats het orgaan in ongeveer 50 millimeter PSS om het te wassen; nadat het weefsel zorgvuldig is gewassen, verwijdert u het omliggende vetweefsel en bindweefsel.Dissekeer de urineblaas open volgens het laurean-type voor glad spierweefsel. Open deze longitudinaal vanaf de blaas hals, het caudale uiteinde, tot aan de top van de koepel. Bereid aan het craniale uiteinde vier stroken voor, zes tot acht millimeter lang en één tot twee millimeter breed, langs het dorsale oppervlak van de resser, waarbij wordt gesneden in de richting van de dominante spierbundels.Plaats het gedissecteerde weefsel en de voorverwarmde en gebubbelde PSS om de calciumindicator te laden met 125 µL van 10 µM organ green 488B in de reageerbuis bij het weefsel en schud deze voorzichtig met de hand om te mengen. Plaats de buis terug in het waterbad. Hervat het bubbelen en dek het waterbad af met een vel folie.De tijd die nodig is voordat voldoende weefsel de calciumindicator heeft opgenomen, varieert afhankelijk van de grootte van het weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Zo is dit voor de detrusormspier van de muis en de oxs van de rat 70 minuten. Voor de detrusormspier van de rat en de VAs deens van de muis incuberen we gedurende 120 minuten.Zodra het weefsel is geladen met de calciumindicator, kan het worden voorbereid voor microscopie. Spoel het weefsel eerst gedurende 10 minuten in gebubbelde PSS. Monteer het weefsel vervolgens in een preparatieschaal met een S-guard.Rek het weefsel lichtjes uit om een plat vlak te vormen. Zet het weefsel vast met korte stukjes, bijvoorbeeld zilverdraad van 2 millimeter lang met een diameter van 25 tot 50 micrometer, en steek de pinnen onder een hoek in.Vermijd het gebruik van spelden die langer zijn dan enkele millimeters, aangezien deze het objectief kunnen bekrassen. Zorgvuldig vastpinnen van het weefsel is belangrijk om spontane contractie van het weefsel te minimaliseren en om het lokaliseren van een geschikte plek voor beeldvorming te vergemakkelijken. Plaats de preparatieschaal op de objecttafel van de microscoop nadat het weefsel is vastgepind.Zorg ervoor dat de PSS niet buiten het gebied van de schaal dat met sil-guard is bekleed stroomt. Dit kan er namelijk toe leiden dat een groot oppervlak met PSS wordt bedekt. Wanneer de superfusie voor demonstratiedoeleinden begint, worden de volgende stappen in het licht uitgevoerd.Let op: deze experimenten worden normaal gesproken in het donker uitgevoerd. Schakel de pomp in om de preparatie te superfuseren. Bij PSS wordt vaak een snelheid van 100 milliliters per uur gebruikt.Zet de verwarmingsunit aan, plaats de in- en uitstroombuizen en de temperatuurprobe op de preparatieschaal en bevestig deze elk aan de metalen strip met de magneet aan de basis. De hoogte van de tip van de uitstroombuis bepaalt de diepte van de PSS. Let erop dat de uitstroom daadwerkelijk PSS verwijdert, aangezien dit soms niet gebeurt.Stel de temperatuur van de verwarmingseenheid aanvankelijk zo in dat de gewenste temperatuur tussen 33 en 35 °C wordt bereikt. Laat het weefsel gedurende ten minste 10 minuten equilibreren met een objectief met lage vergroting (10x of 20x).Gebruik epi-fluorescentie of excitatie met blauw licht om de gladde spier te bekijken en identificeer een geschikt gebied om te monitoren. Omdat blootstelling aan excitatieverlichting de indicator zal doen fotobleken, moet dit niet langer dan enkele seconden per keer worden gebruikt.Vermijd gebieden met heldere structuren, omdat deze een groot aantal fout-positieven in het beelddetectie-algoritme kunnen veroorzaken. Probeer een locatie te kiezen met minimale beweging en een groot aantal gladde spiercellen in het gezichtsveld. Zodra u de locatie voor beeldvorming heeft geselecteerd, schakelt u over naar een objectief met een hogere vergroting, zoals 40 x.Draai de tafel of de optische as zodat de gladdecelsnelheidscel of -cellen horizontaal liggen. Dit is parallel aan de snelle scan-as. De gladdecelsnelheidscellen zijn nu klaar voor beeldvorming via confocale microscopie.In dit protocol gebruiken we een Leica SP two rechtopstaande confocale microscoop. Sluit het pinhole tot één airy disc. Stel de lasersterkte in tussen 25 en 35% op het custo optic instelbare filter.Deze waarde is een compromis tussen helderheid en fotobleken. Download en installeer ImageJ ter voorbereiding op de data-analyse. Download de platformspecifieke versie en update deze vervolgens naar de nieuwste versie door het nieuwste ImageJ jar-bestand te downloaden om het oude bestand te vervangen. Download daarna het Excel writer jar-bestand en installeer dit in de plugins jar-directory.Kopieer deze bestanden naar de plugins-map. Installeer elk van deze scripts met behulp van de plugins-macro's. Installeer de functie van ImageJ. De software voor de Leica SP2-confocale microscoop die wij gebruiken heet Leica.LCS slaat individuele frames van elke serie op als een apart bestand. Om de serie te reconstrueren, moet u ervoor zorgen dat alle te reconstrueren frames in één enkele map staan.Bijvoorbeeld, de tiffs-map met gegevens. Selecteer vervolgens de Leica SP two stacker-macro uit het menu plugins macros. Selecteer de rootdirectory, in dit geval de gegevensmap.Selecteer de gewenste map uit de vervolgkeuzelijst. Kies in dit geval een uitvoermap voor tiffs of maak een nieuwe map aan. Bijvoorbeeld, data folder stacks.Het script zal vervolgens series reconstrueren uit individuele frames om bewegingsartefacten te corrigeren. We maken gebruik van een vrij beschikbaar algoritme dat frames binnen een series-downloadsstack uitlijnt of koppelt, namelijk rig en turbo reg. Kopieer de bestanden voor beide naar de map stacks.Laad een stack die verwerkt moet worden en ga vervolgens naar een frame waarop het interessegebied duidelijk zichtbaar is. Andere frames zullen worden uitgelijnd op dit referentiekader. Ga daarna naar plugins stacks.Stack Reg. Probeer elk van de verschillende transformaties om te bepalen wat het meest effectief is voor elke locatie. Beeldeffecten die de detectie van calciumtransiënten beïnvloeden, zullen variëren door bepaalde eigenschappen en partikelparameters van elke locatie te meten.De gevoeligheid en specificiteit van de detectie worden verhoogd. Daarom berekenen we voor elke locatie de drempelwaarde voor de afgetrokken drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Ga eerst naar plugins, macros, install en selecteer jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ga vervolgens naar plugins macros load stack.Selecteer een reeks en bereken de volgende partikelparameters. Om de drempelwaarde voor aftrekking te berekenen, selecteert u een rechthoekig interessegebied over wat u beschouwt als de achtergrondmeting. Noteer het gemiddelde. Om de drempelwaarde voor de ratio te berekenen, selecteert u een rechthoekig interessegebied rond een optisch vlak gebied van de gladdespiercel of -cellen.Meet de waarden en noteer het gemiddelde en de standaarddeviatie. Herhaal dit proces nog twee keer, of u kunt drie selectievakken tegelijk trekken door op shift te drukken. Bereken en noteer de drempelwaarde voor de ratio.Bereken dit als de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde plus één, en vermenigvuldig vervolgens het resultaat met 32. Bij het middelen van waarden van de drie replica's is de factor 32 noodzakelijk om rekening te houden met het ratio-algoritme, waarbij geen verandering ten opzichte van het voorgaande frame wordt toegewezen aan een gehele waarde van 32. Dit biedt een goed dynamisch bereik om toenames en afnames in de ratio te detecteren.Selecteer voor een 8-bit afbeelding de optie drempelwaarde aanpassen (image adjust threshold). Kies voor zwart-wit. Definieer de bovenste schuifregelaar en noteer de bijbehorende waarde.Dit bevindt zich rechts van de schuifregelaar. Alleen gebeurtenissen die in de zwarte gebieden plaatsvinden, worden geteld. Klik op reset.Nu de drempelwaarde voor de afgetrokken ratio en de drempelwaarde voor de celrand zijn berekend, kunnen we de beeldstacks analyseren. Bepaal de locatie van de te analyseren stacks. Selecteer in deze fase slechts één serie.Dit is het eerste bestand, en het laatste bestand moet gelijk zijn. Selecteer vervolgens een locatie voor de output van de databestanden en stacks. Bijvoorbeeld, de map voor data-output.Voer de waarden in voor de drempelwaarde voor aftrekking, de drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Laat de overige instellingen op hun standaardwaarden staan. Het algoritme genereert een venster met twee panelen, waarin de bewerkte reeks links en het origineel rechts wordt getoond.Open dit bestand vanuit de outputmap en loop hier zorgvuldig doorheen om het aantal fout-positieven en de gevallen waarin met het blote oog zichtbare gebeurtenissen niet zijn gedetecteerd, te beoordelen. Voor elke serie genereert het algoritme een Excel-bestand waarin kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie. Fout-positieven die zijn geïdentificeerd door de door het algoritme gegenereerde afbeeldingsbestanden te beoordelen, kunnen handmatig uit dit Excel-bestand worden verwijderd. Hiervoor dient u echter strikte criteria te hanteren.Dit is een film van calciumtransiënten in glad spierweefsel. In dit voorbeeld bestaat de film uit 100 individuele frames die met een frequentie van vijf hertz zijn opgenomen. We zouden veel van dit soort films per experiment opnemen wanneer we bijvoorbeeld het effect van een specifiek geneesmiddel op de frequentie van de calciumtransiënt onderzoeken.Hier zien we talrijke spontane calciumtransiënten in de gladde spiercellen. Het resultaat van het algoritme voor deeltjesdetectie wordt hier getoond. Voor elke serie genereert het algoritme een Excel-bestand waarin kenmerken van het gedetecteerde event worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie.We hebben een methode gedemonstreerd voor het in beeld brengen van calciumtransiënten in gladde spierorganen, zoals de urineblaas, en we hebben een manier laten zien om deze calciumtransiënten te analyseren met behulp van een algoritme dat we in het lab hebben ontwikkeld. Het is belangrijk om te onthouden dat het weefsel zorgvuldig moet worden voorbereid voor de calciumimaging. In het geval van het weefsel dat we vandaag hebben gedemonstreerd, houdt dit in dat bindweefsel en eventueel vet dat het gezichtsveld kan belemmeren, worden verwijderd.Het is daarnaast belangrijk om het weefsel als een platte laag vast te pinnen. Nou, veel succes met uw experimenten en bedankt voor het kijken.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca2+ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca2+ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Dit protocol presenteert een verzameling sarcomere, calcium en macroscopische geometrische gegevens van een actief samentrekkende cardiale trabecula ex vivo. Deze gelijktijdige metingen worden mogelijk gemaakt door de integratie van drie beeldvormende modaliteiten.

Gelijktijdige Brightfield, Fluorescentie en Optische Coherentie Tomografische Beeldvorming van Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

Het protocol beschrijft de methode om een fluorescerende calciumkleurstof door de gesneden zenuw in de motorische zenuwuiteinden van de muis te laden. Daarnaast wordt een unieke methode gepresenteerd voor het registreren van snelle calciumtransiënten in de perifere zenuwuiteinden met behulp van confocale microscopie.

Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Het huidige protocol beschrijft het voorbereiden en gebruiken van precisiegesneden longplakken van muizen om de luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spiercontractiliteit in een bijna in vivo omgeving te beoordelen.

Gebruik van de precision-cut lung slice om de contractiele regulatie van luchtweg en intrapulmonale arteriële gladde spier te bestuderen

Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.

Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer calciumbeeldvorming in glad spierweefsel van geïsoleerde organen met confocale microscopie. Deze methode analyseert neurotransmittereffecten en calciumsignalering voor fysiologisch onderzoek.

Focus Ca^{2 +} Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Meer video's verkennen