Focus Ca ^{2 +} Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Eerst wordt een calciumlaadoplossing bereid, opgewarmd en belucht. De urineblaas wordt gedissekeerd, geopend, platgepind en er wordt een strip van de detrusorspier genomen. De detrusorstrip wordt toegevoegd aan de laadoplossing, geïncubeerd, gespoeld en platgepind.

De calciumfluorfor binnen het weefsel wordt geëxciteerd door laserlicht en het geëmitteerde licht wordt vervolgens vastgelegd. Films bestaande uit individuele frames worden geanalyseerd door opeenvolgende frames met elkaar te vergelijken. De achtergrond wordt afgetrokken.

De drempelwaarde voor de celrand bepaalt waar gebeurtenissen kunnen worden gevonden en er wordt een ratio tussen opeenvolgende hersenen berekend. Als de overgebleven gebeurtenissen voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria, worden ze gemarkeerd en gelabeld. Hallo, mijn naam is John Young van de laboratoria van Keith Brain en Tom Kinane bij de afdeling Farmacologie van de Universiteit van Oxford.

Ik ben Rob Amos, ook van de Brain- en Canne-labs, en mijn naam is Keith Brain. Vandaag zullen John en Rob u een calcium-imagingtechniek in glad spierweefsel laten zien. We gebruiken dit in ons laboratorium om de afgifte van neurotransmitters vanuit autonome zenuwen en het effect hiervan op glad spierweefsel te bestuderen.

Laten we beginnen. De calciumindicator Organ Green 488 Basta komt in vials van 500 µL die 50 µg poeder bevatten. Om de calciumindicator te bereiden, voegt u 40 µL Onic F1 27-oplossing toe aan het poeder en schudt u dit gedurende 30 seconden voorzichtig. Voeg daarna 460 µL fysiologische zoutoplossing (PSS) toe en schud opnieuw voorzichtig gedurende 30 seconden.

De uiteindelijke oplossing, 10 µM Organ Green 488 BSA, levert vier aliquots van elk 125 µL op. Vermijd blootstelling aan licht en bewaar de oplossing bij -20 °C vóór het dissecteren van het betreffende weefsel.

Haal de calciumindicator uit de vriezer en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur terwijl de calciumindicator nog bevroren is. Plaats één milliliter PSS in een reageerbuis en in een waterbad van 33 °C. Bevestig een belufter in de reageerbuis met een stop, of gebruik Parafilm, en belucht vervolgens met een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide met een snelheid van ongeveer één bel per seconde.

Dissekeer het gladspierorgaan uit het dier. In dit geval is dit de urineblaas van een muis. Plaats het orgaan in ongeveer 50 millimeter PSS om het te wassen; nadat het weefsel zorgvuldig is gewassen, verwijdert u het omliggende vetweefsel en bindweefsel.

Dissekeer de urineblaas open volgens het laurean-type voor glad spierweefsel. Open longitudinaal vanaf de blashals, het caudale uiteinde tot aan de top van de dome. Bereid aan het craniale uiteinde vier stroken voor, zes tot acht millimeter lang en één tot twee millimeter breed, langs het dorsale oppervlak van de resser, waarbij u snijdt in de richting van de dominante spierbundels.

Plaats het gedissecteerde weefsel en de vooraf verwarmde en beluchte PSS om de calciumindicator te laden met 125 µL organ green 488 B van 10 µM aan het weefsel in de reageerbuis en schud deze voorzichtig met de hand om te mengen. Plaats de buis terug in het waterbad. Hervat het beluchten en dek het waterbad af met een vel folie.

De tijd die nodig is voor voldoende weefselopname van de calciumindicator varieert afhankelijk van de grootte van het weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Voor de detrusor van de muis en de oxs van de rat bedraagt dit bijvoorbeeld 70 minuten. Voor de detrusor van de rat en de VAs van de muis incuberen we daarentegen gedurende 120 minuten.

Zodra het weefsel is geladen met de calciumindicator, kan het worden voorbereid voor microscopie. Spoel het weefsel eerst 10 minuten in gebubbelde PSS. Monteer het weefsel vervolgens in een preparatieschaal met een S-guard voering.

Rek het weefsel enigszins uit om een vlakke laag te vormen. Zet het weefsel vast met korte stukjes, bijvoorbeeld zilverdraad met een diameter van 25 tot 50 µm en een lengte van twee millimeter, en steek de pinnen onder een hoek in.

Vermijd het gebruik van spelden die langer zijn dan enkele millimeters, omdat deze het objectief kunnen bekrassen. Zorgvuldig vastspelden van het weefsel is belangrijk om spontane beweging van het weefsel te minimaliseren en om het lokaliseren van een geschikte plaats voor beeldvorming te vergemakkelijken. Nadat het weefsel is vastgespeld, plaatst u de preparatieschaal op de microscooptafel.

Zorg ervoor dat de PSS niet buiten het met sil-guard beklede gebied van de schaal terechtkomt, aangezien dit ertoe kan leiden dat een groot oppervlak met PSS wordt bedekt. Wanneer de superfusie voor demonstratiedoeleinden begint, worden de volgende stappen in het licht uitgevoerd.

Houd er rekening mee dat deze experimenten normaal gesproken in het donker worden uitgevoerd. Zet de pomp aan om het preparaat te perfuseren. Bij PSS wordt vaak een snelheid van 100 milliliters per uur gebruikt.

Schakel de verwarmingsunit in, plaats de in- en uitstroombuizen en de temperatuursensor op de preparatieschaal en bevestig deze elk aan de metalen strip met de magneet op de basis. De hoogte van de punt van de uitstroombuis bepaalt de diepte van de PSS. Let er zorgvuldig op dat de uitstroom daadwerkelijk PSS verwijdert, aangezien dit soms niet gebeurt.

Stel de temperatuur op de verwarmingsunit aanvankelijk zo in dat de gewenste temperatuur tussen 33 en 35 °C wordt bereikt. Laat het weefsel gedurende ten minste 10 minuten equilibreren met een objectief met lage vergroting, 10x of 20x.

Gebruik epi-fluorescentie of excitatie met blauw licht om de gladde spieren te bekijken en een geschikt gebied te identificeren voor monitoring. Aangezien blootstelling aan excitatieverlichting de indicator zal doen fotobleken, dient het gebruik beperkt te blijven tot maximaal enkele seconden per keer.

Vermijd gebieden met heldere structuren, omdat deze een hoog aantal fout-positieven in het beelddetectie-algoritme kunnen veroorzaken. Probeer een locatie te kiezen met minimale beweging en een groot aantal gladde spiercellen in het gezichtsveld. Zodra u de locatie voor de beeldvorming heeft geselecteerd, schakelt u over naar een objectief met een hogere vergroting, zoals 40 x.

Draai de tafel of de optische as zodat de gladdespiercel of -cellen horizontaal liggen. Dit is parallel aan de as van de snelle scan. De gladdespiercellen zijn nu klaar voor beeldvorming via confocale microscopie.

In dit protocol maken we gebruik van een Leica SP2 rechtopstaande confocale microscoop. Sluit het pinhole tot één airy disc. Stel de laserintensiteit in tussen 25% en 35% op het custo optic instelbare filter.

Deze waarde is een compromis tussen helderheid en fotobleking. Download en installeer ImageJ ter voorbereiding op de data-analyse. Download de versie die specifiek is voor uw platform en update vervolgens naar de nieuwste versie door het nieuwste ImageJ jar-bestand te downloaden om het oude bestand te vervangen. Download vervolgens het Excel writer jar-bestand en installeer dit in de plugins jar-map.

Kopieer deze bestanden naar de plugins-directory. Installeer elk van deze scripts met behulp van de plugins-macro's. Installeer de functie van ImageJ. De software voor de Leica SP2 confocale microscoop die we gebruiken wordt Leica genoemd.

LCS slaat individuele frames van elke serie op als een apart bestand. Om de serie te reconstrueren, moet u ervoor zorgen dat alle frames die gereconstrueerd moeten worden zich in één enkele map bevinden.

Bijvoorbeeld, de tiffs-datafolder. Selecteer vervolgens de Leica SP two stacker macro uit het menu plugins macros. Selecteer de rootdirectory, in dit geval de datafolder.

Selecteer de gewenste map uit de vervolgkeuzelijst. Selecteer in dit geval een uitvoermap voor tiffs of maak een nieuwe aan. Bijvoorbeeld, data folder stacks.

Het script zal vervolgens series reconstrueren vanuit individuele frames om bewegingsartefacten te corrigeren. We maken gebruik van een freely available algoritme dat frames binnen een series downloads stack, rig en turbo reg uitlijnt of koppelt. Kopieer de bestanden voor elk hiervan naar de stacks-map.

Laad een stack die verwerkt moet worden en ga vervolgens naar een frame waarin het interessante veld duidelijk zichtbaar is. Andere frames zullen worden uitgelijnd op dit referentiekader. Ga daarna naar plugins stacks.

Stapelregistratie. Probeer elke verschillende transformatie om te bepalen wat het meest effectief is voor elke locatie. Beeldgevingsfactoren die de detectie van calciumtransiënten beïnvloeden, zullen variëren door bepaalde eigenschappen, de partikelparameters van elke locatie, te meten.

De gevoeligheid en specificiteit van de detectie worden verhoogd. Daarom berekenen we voor elke locatie de drempelwaarde voor de afgetrokken drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Ga eerst naar plugins, macros, install en selecteer jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Ga vervolgens naar plugins macros load stack.

Selecteer een reeks en bereken de volgende partikelparameters. Om de drempelwaarde voor aftrekking te berekenen, selecteert u een rechthoekig ROI-gebied (region of interest) over wat u beschouwt als de achtergrondmeting. Noteer het gemiddelde. Om de drempelwaarde voor de ratio te berekenen, selecteert u een rechthoekig ROI-gebied rond een optisch vlak gebied van de gladde spiercel of cellen.

Meet en noteer het gemiddelde en de standaardafwijking. Herhaal dit proces nog twee keer, of u kunt drie kaders tegelijk trekken door shift in te drukken. Bereken en noteer de drempelwaarde voor de ratio.

Bereken de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde plus één, en vermenigvuldig vervolgens het resultaat met 32. Bij het middelen van waarden uit de drie replica's is de factor 32 nodig om rekening te houden met het ratio-algoritme, waarbij geen verandering ten opzichte van het vorige frame wordt gekoppeld aan een gehele waarde van 32. Dit biedt een goed dynamisch bereik om toenames en afnames in de ratio te detecteren.

Selecteer voor een afbeelding van acht bit 'image adjust threshold'. Selecteer zwart-wit. Definieer de bovenste schuifregelaarlimiet en noteer de overeenkomstige waarde.

Dit bevindt zich rechts van de schuifregelaar. Alleen gebeurtenissen die in de zwarte regio's plaatsvinden, worden geteld. Klik op reset.

Nu de drempelwaarde voor de afgetrokken ratio en de drempelwaarde voor de celrand zijn berekend, kunnen we de beeldstacks analyseren. Bepaal de locatie van de te analyseren stacks. Selecteer in dit stadium slechts één serie.

Dat is het eerste bestand, en het laatste bestand moet hetzelfde zijn. Selecteer vervolgens een locatie voor de uitvoer van de gegevensbestanden en stacks. Bijvoorbeeld, een map voor gegevensuitvoer.

Voer de waarden in voor de drempelwaarde voor aftrekking, de drempelwaarde voor de ratio en de drempelwaarde voor de celrand. Laat de overige instellingen op hun standaardwaarden staan. Het algoritme genereert een venster met twee panelen waarin de bewerkte reeks links en het origineel rechts wordt getoond.

Open dit bestand vanuit de outputmap en loop hier zorgvuldig doorheen om het aantal fout-positieven en de gevallen waarin met het oog zichtbare gebeurtenissen niet zijn gedetecteerd, te beoordelen. Voor elke reeks genereert het algoritme een Excel-bestand waarin de kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie; fout-positieven die zijn geïdentificeerd door de door het algoritme gegenereerde afbeeldingsbestanden te beoordelen, kunnen handmatig uit dit Excel-bestand worden verwijderd. Hanteer hierbij strikte criteria.

Dit is een video van calciumtransiënten in glad spierweefsel. In dit voorbeeld bestaat de video uit 100 afzonderlijke frames die met een frequentie van vijf hertz zijn vastgelegd. We leggen veel van dit soort video's vast per experiment wanneer we bijvoorbeeld het effect van een bepaald geneesmiddel op de frequentie van de calciumtransiënt onderzoeken.

Hier zien we talrijke spontane calciumtransiënten in de gladde spiercellen. Het resultaat van het algoritme voor deeltjesdetectie wordt hier getoond. Voor elke serie produceert het algoritme een Excel-bestand waarin de kenmerken van het gedetecteerde event worden gespecificeerd, zoals amplitude, oppervlakte en positie.

We hebben een methode gedemonstreerd voor het in beeld brengen van calciumtransiënten in gladde spierorganen, zoals de urinewezig, en we hebben een manier laten zien om deze calciumtransiënten te analyseren met behulp van een algoritme dat we in het laboratorium hebben ontwikkeld. Het is essentieel om te onthouden dat het weefsel goed voorbereid moet worden voor de calciumimaging. In het geval van het weefsel dat we vandaag hebben gedemonstreerd, houdt dit in het verwijderen van bindweefsel en alle vetresten die het gezichtsveld kunnen belemmeren.

Het is ook belangrijk om het weefsel als een plat vel vast te pinnen. Nou, veel succes met uw experimenten en bedankt voor het kijken.