Lens transplantatie in de zebravis en de toepassing ervan in de Analyse van Eye Mutanten
1 juni 2009
Lens ontwikkeling houdt interacties met andere weefsels. Verschillende zebravis oog mutanten worden gekenmerkt door een abnormaal kleine lens formaat. Hier laten we zien een lens transplantatie experiment om te bepalen of dit fenotype is te wijten aan intrinsieke oorzaken of defecte interacties met weefsels die de lens omringen.
Om te beginnen met lenstransplantatie in zebravis, worden GFP-expresserende transgene donoren en wilde-type recipiënten eerst gedurende 30 minuten geïncubeerd in afzonderlijke petrischalen met calciumvrije zebravis-Ringer-oplossing. De vislarven worden vervolgens ingebed in twee parallelle lijnen in laagsmeltende agarose. Eén lijn (A) is voor de donoren en de andere (B) voor de recipiënten. Bij de recipiënten wordt het gehele oog verwijderd, terwijl bij de donoren alleen de lens wordt verwijderd.
De weefsels rondom de donorlens worden verwijderd voordat de lens in het oog van de ontvanger wordt geplaatst. Na transplantatie worden de vissen bewaard in gelabelde 24-wells platen. De getransplanteerde lens moet GFP-fluorescentie vertonen in de ontvanger.
Natuurlijk is het contralaterale oog van de gastheer niet geopereerd en expresseert dit geen GFP. Hoi, ik ben Yj. En ik ben Kaya McCullough, en we komen uit het laboratorium van Dr. Yma Maki van de afdeling Oftalmologie aan de Harvard Medical School. Vandaag laten we u een procedure zien voor lenstransplantatie in wild-type zebravissen Daniel Rio.
Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om lenzen te transplanteren van wild-type naar mutante dieren en vice versa. Hiermee kunnen we bepalen of mutante genen autonoom of niet-autonoom functioneren in de lens. Laten we beginnen.
Zebravissenstammen worden gehouden onder standaardvisfaciliteitscondities bij 28,5 °C met een cyclus van 14 uur licht en 10 uur donker. Op de avond vóór het geplande experiment worden mannetjes en vrouwtjes in een tank geplaatst met een scheidingsscherm om hen van elkaar te scheiden. Het genotype van deze vissen moet nakomelingen opleveren met GFP-expressie en de betreffende mutatie. Gebruik parallel dezelfde procedure om binnen één uur kruisingen op te zetten tussen niet-transgene wildtype dieren.
Zodra het licht 's ochtends aangaat, verwijdert u de scheidingswanden zodat de vissen kunnen paren. Na 15 tot 30 minuten giet u het aquariumwater door een zeef om de embryo's op te vangen en spoelt u deze vervolgens met een straal eitjeswater uit een spoelfles in een Petrischalen van 100 bij 15 millimeter. Maak de eitjes daarna schoon door onbevruchte embryo's en eventueel vuil met een pipet te verwijderen.
Vervang het oude eierwater door nieuw eierwater. De embryo's kunnen vóór de lenstransplantatie worden bewaard in een incubator bij 28,5 °C. Wanneer u klaar bent om over te gaan tot de transplantatie, bereidt u de embryo's voor door het chorion handmatig te verwijderen.
Met een metalen sonde en een pincet moeten de met dec gecoate embryo's nu 30 minuten worden geïncubeerd in 0,2% EDTA in calciumvrij ZFR. Tijdens de incubatie kunnen de naalden die nodig zijn voor de dissectie worden klaargemaakt. De transplantatieprocedure vereist een verscherpte naald om de weefsels rond de lens en de embryo's uit de agros door te snijden.
Er is ook een stompe naald nodig om de donorenslens te verplaatsen en in de gastheer te plaatsen; maak deze naald door eerst de punt van een Pasteur-pipet af te snijden met een diamantmes. Voeg vervolgens een glazen capillair toe aan de punt van de Pasteur-pipet, zodanig dat ongeveer de helft van de lengte ervan erin zit. Voer voorzichtig een dunne wolfraamdraad in het open uiteinde van het capillair in met behulp van een vlam.
Smelt het glas boven het draad; houd met een pincet het glazen uiteinde stevig vast met een metaaldraad terwijl u het andere uiteinde van de naald draait. Het verzachte glas moet zich in een spiraal rond het metaal wikkelen, zodat het stevig wordt vastgezet. Hiermee wordt een stompe naald gemaakt om vervolgens een scherpe naald te creëren.
Houd de wolfraamdraad één tot 1,5 minuut boven een vlam om het metaal weg te branden, zodat er een zeer fijne punt ontstaat. Controleer de kwaliteit van de punt via microscopie.
Een goede pipetpunt mag niet buigen of krommen en moet vloeiend taps toelopen naar een fijne punt, met een diameter van maximaal 50 micrometers. Steriliseer beide naalden enkele seconden in de vlam en laat ze afkoelen voordat u aan de procedure begint in een plastic centrifugebuis; bereid 1,2% low melting point aros en calciumvrije ZFR voor, voorverwarmd tot 40 °C in een waterbad. Neem de donorembryo's op in een pasture-pipet en breng ze langzaam over in de centrifugebuis met aros. Incubeer de eieren ongeveer vijf seconden in de aros.
Verwijder de embryo's met de pipet en plaats ze in een rij op een polystyreen Petri-schaal van honderd millimeter door langzaam en voorzichtig te pipetteren; de meeste embryo's zullen op hun zij liggen met het oog naar boven gericht. Herhaal dit proces nu met de gasteneieren en plaats deze in een rij parallel aan de donoreieren voordat de agar stolt. Gebruik de stompe naald om eventuele onjuist georiënteerde embryo's te draaien, zodat het oog naar boven is gericht wanneer de agar is gestold.
Bedek het met een 0,2% laagsmeltende agarose-oplossing. Verwijder met een scherpe naald alle agarose rond de ogen en snijd zeer voorzichtig het gehele donoreng leaving uit, dat zal gaan drijven. Laat vervolgens de lens uit het oog ontsnappen.
Dit wordt gedaan door de naald van onder naar boven door het oogweefsel te trekken. Alleen voor de gastheer. De lens wordt uitgesneden met kleine bewegingen met een verscherpte naald, waarbij zo dicht mogelijk langs de lens wordt gesneden zonder deze te scheuren.
Vermijd het verwijderen van te veel weefsel uit de rest van het oog van de gastheer. Zodra ze zijn losgemaakt, zullen de lenzen in het medium drijven. Duw de donorlens met de stompe naald voorzichtig tot net boven de positie van de lens van de gastheer en duw deze vervolgens met een stompe naald op zijn plaats.
De lens van de gastheer mag worden weggegooid. Laat de embryo's van de donor en de gastheer 30 tot 60 minuten in 1,2% Aros rusten. Het embryo-medium bevordert de wondgenezing.
Bevrijd ze vervolgens uit de agros met behulp van de geslepen metalen naald. Breng de embryo's over naar een 24-wells plaat met embryo-medium. Elk embryo moet in een aparte well worden geplaatst.
Zorg ervoor dat de wells correct worden gelabeld, zodat duidelijk is welke gast correspondeert met welke donor nadat de lenstransfer is voltooid. Laat de embryo's zich ontwikkelen bij 28.5 °C tot het gewenste tijdstip. Voor fenotypische observatie onderzoeken we gewoonlijk de lensdifferentiatie binnen één tot twee dagen.
De lens afkomstig van de donor moet GFP-expressie behouden na transplantatie in het oog van de gastheer. Als een mutantfenotype niet wordt hersteld in de wildtype-omgeving, geeft dit aan dat het fenotype autonoom is. Indien het echter wel wordt hersteld, wordt het fenotype als niet-autonoom beschouwd.
En dit heeft belangrijke implicaties voor de functie van het onderliggende gen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een transplantatie van de lens in het zebravissenembryo uitvoert. Bij deze procedure is het belangrijk om zeer zorgvuldig te zijn met de manier waarop u de naalden vormgeeft en hoe u de lens zelf uitdissecteert.
Daarnaast moeten de embryo's snel worden gerangschikt voordat de eieren beginnen te rollen zodra de transplantatie is voltooid. Vergeet niet om embryo-medium toe te voegen aan de acht in het houten genezingsmedium. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de lensontwikkeling bij zebravissen, met de nadruk op de interacties tussen de lens en het omringende weefsel. Er wordt een lenstransplantatie-experiment uitgevoerd om vast te stellen of de waargenomen kleine lensgrootte bij bepaalde zebravismutanten wordt veroorzaakt door intrinsieke factoren of door defecte weefselinteracties.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Zebravisen dienen als modelorganisme voor het bestuderen van de oogontwikkeling.
- Mutaties bij zebravisen kunnen leiden tot diverse oogafwijkingen, waaronder abnormaliteiten in de lensgrootte.
- Inzicht in interacties tussen lensweefsels is essentieel voor het begrijpen van ontwikkelingsprocessen.
- Transplantatie-experimenten kunnen helpen bij het verhelderen van de oorzaken van deze defecten.
Doel van de studie
- Om vast te stellen of de geringe lensgrootte bij zebravismutanten wordt veroorzaakt door intrinsieke lenseigenschappen.
- Om de rol van het omliggende weefsel bij de lensontwikkeling te evalueren.
- Om lenstransplantatie te gebruiken als methode om deze interacties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Transgene zebravis die GFP tot expressie brachten, werden gebruikt als lensdonoren.
- Wild-type zebravis dienden als gasten voor lenstransplantatie.
- De vissen werden voor de operatie geïncubeerd in een calciumvrije oplossing.
- De lenstransplantatie bestond uit het verwijderen van de donorlens en het plaatsen hiervan in het oog van de gast.
Belangrijkste resultaten
- De getransplanteerde lens vertoonde GFP-fluorescentie in de gastheer, wat een succesvolle transplantatie bevestigt.
- De resultaten wijzen erop dat afwijkingen in de lensgrootte beïnvloed kunnen worden door het omringende weefsel.
- De transplantatiemethode bleek effectief voor het bestuderen van de lensontwikkeling.
- Verdere analyse is nodig om de mechanismen achter de waargenomen fenotypes te onderzoeken.
Conclusies
- Lenstransplantatie is een waardevolle techniek voor het onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.
- Interacties tussen de lens en het omliggende weefsel zijn cruciaal voor een normale lensontwikkeling.
- Toekomstige studies moeten zich richten op het identificeren van specifieke factoren die betrokken zijn bij deze interacties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Lenstransplantatie in zebravissen maakt een nauwkeurige dissectie mogelijk van celautonome versus niet-autonome genetische effecten bij de oogontwikkeling, wat direct bijdraagt aan strategieën voor targetvalidatie bij ontwikkelingsstoornissen van het oog. Deze aanpak biedt voorspellende zekerheid bij het onderscheiden van intrinsieke lensdefecten van defecten die worden aangestuurd door weefselinteracties, wat risico-gecorrigeerde beslissingen ondersteunt bij vroege discovery en de selectie van preklinische modellen. Het vermogen van deze methode om mechanistische ambiguïteit te verduidelijken, verbetert de prioritering van portfolio's voor oogheelkundige therapeutische programma's.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele ondervraging van genautonomie bij lensontwikkeling mogelijk met behulp van combinaties van mutant en wildtype weefsel.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke drijvers van mutante fenotypes.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets voor modellen van oogziekten.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde, genetisch gedefinieerde zebravis-systemen vast voor downstream fenotypische screening.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van lensdifferentiatie en rescue-resultaten mogelijk via GFP-labeling.
- Ondersteunt assay-standaardisatie voor het evalueren van genetische of farmacologische interventies in de oogontwikkeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt zebrafish-lensfenotypes af met de vertebrale oculaire biologie, wat de ontwikkeling van translationele biomarkers ondersteunt.
- Biedt continuïteit van genetische ontdekking tot preklinische validatie van kandidaat-targets in ziekterelevante systemen.
- Vermindert het biologische risico in een laat stadium door de genfunctie in de context van een volledig organisme te verduidelijken.
Integratie van pipeline en workflow
Deze transplantatiemethode vormt de schakel tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waarbij genetische targetvalidatie wordt verbonden met functionele fenotypering in een gewervde modelorganisme.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing betreffende genautonomie en weefselinteractie bij de ontwikkeling van de lens.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van lensredding of het aanhouden van mutante fenotypen.
- Analytiek: Maakt statistische vergelijking van fenotypische uitkomsten tussen experimentele groepen mogelijk met behulp van GFP-markers.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van zebravisfenotypen met mechanismen van menselijke oogziekten.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse genetische mutaties en kandidaat-interventies bij de oogontwikkeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor oogaandoeningen.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor transplantatie en fenotypering voor schaalbare, reproduceerbare studies.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen door genfuncties en weefselinteracties in een vroeg stadium van de pipeline te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische targets en modelsystemen mogelijk voor oogheelkundige R&D.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met zebravis, microdissectie en fluorescentiegebaseerde fenotypering.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie voor embryomanipulatie en beeldvorming van GFP-gelabelde weefsels.
- Maakt strikte standaardisatie van transplantatie- en scoringsprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van protocollen en ontwikkeling van genetische instrumenten vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten technische variabiliteit in het succes van transplantaties en de fenotypische beoordeling.
