Name: Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Leer hoe je lactogene differentiatie induceert in HC11 muizenborstweefselepitheelcellen door mammosfeervorming te monitoren. Dit protocol biedt een betrouwbaar in vitro model om de regulatie van borstweefseldifferentiatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fondsen uit Congressionally Geregisseerd Medical Research Fund-subsidie ​​(DAMD17-01-0264) naar ML Cutler en de Verenigde Staten militaire Kanker Instituut naar ML Cutler wordt ondersteund het werk.

<ol><li> De HC11 cellen werden gekweekt tot confluentie gedurende 6 dagen in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal kalf serum, 5μg/ml insuline, 10 mM HEPES, 10ng/ml epidermale groeifactor (EGF) de bekwaamheid vast te stellen. </li><li> De cellen werden gewassen met PBS en onderhouden groei media zonder EGF voor 24 uur. </li><li> Voor het induceren van lactogenic differentiatie van de cellen werden geïncubeerd in differentiatie media, dat wil zeggen RPMI met dexamethason (10 -6 M), insuline (5 ug / ml) en prolactine (5 ug / ml) aangeduid als DIP. </li><li> Op de aangegeven tijden post-DIP Daarnaast werden mammospheres gefotografeerd en geïnventariseerd door fase-contrast-microscopie met behulp van een Olympus IX71 microscoop met digitale camera. </li></ol> Representatieve resultaten: Laag stroomverbruik vergroting van de normale borstklier epitheliale celmonolagen en meerdere mammospheres, evenals een hoog vermogen vergroting van een enkele mammosphere zijn weergegeven in figuur 1, respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Figuur 1. Mammospheres. (A) Normale borstklieren epitheelcellen monolayers moet worden weergegeven als een vlakke laag van samenvloeiende cellen. (B) Na 3-5 dagen van de DIP-stimulatie meerdere mammospheres verschijnen. Foto genomen vijf dagen na de DIP-toevoeging. (C) Hogere vergroting van een veld met mammospheres na 5 dagen na de DIP-toevoeging.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Om deze techniek succesvol te zijn en van de beste kwaliteit, de epitheliale cellen moet worden gehandhaafd op samenloop alvorens te worden geïnduceerd met lactogenic hormonen. Er kunnen situaties zijn waarin er talrijke mammospheres, waardoor de kwantificering moeilijk. Dus, voor kwantitatieve doeleinden is het best om de mammospheres fotograferen op een tijdstip als het aantal mammospheres is in staat moet worden geteld. Hoewel er verschillende moleculaire merkers worden gebruikt om de mat...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

muis uier epitheelcellen vorm mammospheres tijdens lactogenic differentiatie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Een fenotypische die vaak wordt gebruikt om de mate van lactogenic differentiatie in muis borstklieren epitheelcellen culturen te bepalen, is de vorming van koepelvormige celstructuren aangeduid als mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. De HC11 cellijn is werkzaam als een modelsysteem voor de studie van de regulering van mammaire lactogenic differentiatie zowel<em&gt; In vitro</em&gt; En<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. De HC11 cellen differentiëren en melkeiwitten synthetiseren in reactie op de behandeling met lactogenic hormonen. Naar aanleiding van de groei van de HC11 muis mamma-epitheliale cellen tot confluentie, was lactogenic differentiatie geïnduceerd door de toevoeging van een combinatie van lactogenic hormonen waaronder dexamethason, insuline, en prolactine, aangeduid als DIP. De HC11 cellen geïnduceerd om te differentiëren werden gefotografeerd soms tot 120 uur na inductie van differentiatie en het aantal mammospheres dat verscheen in elke cultuur werd opgesomd. De grootte van de individuele mammospheres correleert met de mate van differentiatie en dit is afgebeeld in de beelden van de differentiërende cellen.

HC11 lactogenic differentiatie kan worden gekenmerkt door de vorming van overkoepelde bedoelde structuren als mammospheres. De structuren kunnen worden opgesomd door de fase-contrast-microscopie om te helpen bij het kwantificeren van lactogenic differentiatie.

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

Een fenotypische maat die veelvuldig wordt gebruikt om de graad van lactogene differentiatie in kweekcellen van het melkkleirepitheel van muizen te bepalen, is de vorming van ...

Hallo, ik ben Bethany Morrison uit het laboratorium van Dr. Mary Lou Cutler van de afdeling Pathologie aan de Uniform Services University of the Health Sciences. Vandaag laten we u een procedure zien voor de ontwikkeling van mammosferen uit HC 11-epitheelcellen van de muisborstklier. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om lactodifferentiatie te bestuderen.Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, worden HC 11-cellen gedurende zes dagen tot confluentie gekweekt in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 5 µg/mL insuline, 10 µM Heiss en 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) om competentie te vestigen.Deze cellen zijn uitgebreid gebruikt door de laboratoria van Nancy Hines en Bernard Groner om de regulatie van genische differentiatie in de weefselkweekkap te bestuderen. De cellen worden vervolgens gewassen met PBS en 24 uur lang in groeimedium zonder EGF gehouden. Na deze incubatie worden de cellen geïncubeerd in differentiatimedium bestaande uit RPMI aangevuld met dexamethason, insuline en prolactine om lacto-differentiatie na incubatie te induceren.In de differentiatiemedia wordt een Olympus IX 71-microscoop, uitgerust met een digitale camera, gebruikt om de mammosferen te fotograferen en te tellen. Middels fasecontrastmicroscopie worden de mammosferen meerdere malen gefotografeerd en geteld gedurende 120 uur na inductie. Deze afbeelding toont een lage vergroting van een normale mammosfeer.Epitheliale cellmonolagen moeten ongeveer drie dagen voor stimulatie met genische hormonen op confluentie worden gehouden. Hier is een blik op nieuwe mammosferen die drie dagen na inductie zijn gevormd, bij een lage vergroting. Ze beginnen te verschijnen als kleine koepelvormige structuren die willekeurig verspreid zijn tussen de epitheliale cellen.Opnieuw bij lage vergroting. Hier is een beeld van meerdere mammosferen die zich vijf dagen na inductie hebben ontwikkeld. De mammosferen zijn hier bij hoge vergroting in zowel grootte als aantal blijven groeien; het bubbel- of koepelachtige kenmerk van de mammosfeer is duidelijk zichtbaar.We hebben zojuist laten zien hoe u geheugenepitheelcellen induceert, zodat ze mammosferen vormen, die worden gebruikt als markers voor genische differentiatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen vóór de inductie confluent moeten blijven, omdat de cellen in deze periode matrixeiwitten produceren waarmee ze moeten interageren om volledig in staat te zijn te reageren op genische hormonen. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat EGF uit het medium moet worden verwijderd vóór de behandeling, omdat EGF het differentiatieproces zal remmen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

mouse-mammary-epithelial-cells-form-mammospheres-during-lactogenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Deze video beschrijft het isoleren van kankerstamcellen van borstkankercellijnen. We kweeken deze kankerstamcellen om primaire mammosfeer te genereren voor het beoordelen van zelfvernieuwing en het berekenen van sfeervormende efficiëntie, waardoor vergelijking tussen verschillende zaaidichtheden mogelijk is.

Generatie van primaire mammosfeer: een techniek om celpotentie te bepalen

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Hier beschrijven we de uitvoering en interpretatie van de resultaten van een in vitro mammosphere zelf vernieuwing kwantitatieve assay.

Kwantificering van zelf vernieuwing in Muriene Mammosphere culturen

De borstklier is een tweelaagse structuur, bestaande uit buitenste myoepitheel en binnenste luminale epitheelcellen. Gepresenteerd is een protocol voor de voorbereiding van organoïden met behulp van differentiële trypsinisatie. Deze efficiënte methode stelt onderzoekers in staat om deze twee celtypen afzonderlijk te manipuleren om vragen over hun rol in de vorm en functie van de borstklier te onderzoeken.

Generatie van Mozaïek Borstorganoïden door Differentiële Trypsinization

Dit protocol beschrijft de methode voor het opzetten van de mammosfeervormingstest om Apoptosis Inhibitor 5 (Api5)-geïnduceerde kankerstam in niet-tumorogene borstepitheelcellen te bestuderen. Lysaten die uit mammosferen van de primaire generatie worden verzameld, worden geanalyseerd op verschillende stammarkeringen om de inductie van stamcelachtige eigenschappen te beoordelen.

Mammosfeertest onthult Api5-geïnduceerde stamheid in niet-tumorogene borstepitheelcellijnen

Leer hoe je lactogene differentiatie induceert in HC11 muizenborstweefselepitheelcellen door mammosfeervorming te monitoren. Dit protocol biedt een betrouwbaar in vitro model om de regulatie van borstweefseldifferentiatie te bestuderen.

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

Meer video's verkennen