Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator
2 juli 2009
Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel opwinding tot het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op longweefsel wordt uitgelegd.
In dit videoprotocol zie je hoe je volwassen muislongweefsel dissocieert met behulp van Gentle Max na de dissociatie van longweefsel. In aanwezigheid van collagenase d en DNAS een celsuspensies worden gefilterd met behulp van een 70 micron celzeefcentrifuge en opgehangen voor verdere toepassingen. Hoi, ik ben Melanie Mlu van Mil Biotech in Duitsland.
Vandaag laat ik je een reproduceerbare en geautomatiseerde procedure zien voor de bereiding van een enkele celsuspensie uit muislongweefsel door gebruik te maken van de GenX-dissociatie. We gebruiken deze procedure in ons lab om enkele celsuspensies te bereiden voor de bereiding van leukocyten of endotheelcellen. Oké, laten we beginnen.
Voordat we beginnen met het protocol, moeten een paar standaardoplossingen worden bereid en klaar staan. Ten eerste hebben we Hebes-buffer nodig. Ten tweede een collagenase D-oplossing met 100 milligram per milliliter enzym en hebes-buffer.
Ten derde, een dase een-oplossing met 20.000 eenheden per milliliter dase een. Ten slotte, twee veelvoorkomende bufferoplossingen. Een typische PBS-buffer bij pH 7,2 en een PEB-buffer afgeleid van AutoMax-spoeloplossing en BSA-voorraadoplossing.
We beginnen ons protocol met een gedissekteerde long van een zes tot zeven weken oude vrouwelijke biopsiemuis. Zorg ervoor dat de long vrij is van aangrenzende organen zoals het hart en de thymus, efferente en afferent bloedvaten, trachea en bindweefsel. Spoel het weefsel in een petrischaaltje met PBS om erytrocyten te verwijderen.
Typisch weegt een muislong op deze leeftijd tussen de 110 en 150 milligram. Als je van plan bent om longen van oudere dieren of andere muisstammen te associëren, weeg dan het weefsel en de buffer. Er kan maximaal 450 milligram weefsel per buis worden gedissocieerd.
Breng het longweefsel over naar een Gentle Max C-buis geladen met 4,9 milliliter heis-buffer. Voeg 100 microliter collagenase D-oplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter aan het longweefsel en de buffer. Nu 10 microliter dase.
Een oplossing voor meer dan 150 milligram weefsel. Voeg 20 microliter dase een-oplossing toe. Zorg ervoor dat de C-buis goed gesloten is en plaats hem ondersteboven op de Gentle Max Dis.
Zorg ervoor dat het weefsel zich tussen de rotor en de stator bevindt. Selecteer het longprogramma en voer het uit door op de startknop te drukken wanneer het programma is voltooid. Verwijder de C-buis uit het instrument en incubeer het monster gedurende 30 minuten.
In een incubator van 37 graden Celsius tijdens de incubatie, moet de buis worden geroteerd met behulp van de max mix-buisrotator of handmatig om de vijf minuten worden gedraaid. Na de incubatie, brengt u de C-buis terug in de Gentle Max Associator en voert u het tweede longprogramma uit. Terwijl het programma wordt uitgevoerd, bereidt u een 50 milliliterbuis voor voor het verzamelen van gefilterde cellen door de dop te vervangen door een 70 micrometer maascelzeef. Zodra het gedissocieerde programma is voltooid, kunt u, afhankelijk van de verdeling van monstermateriaal in de buis, de buis kort centrifugeren om het monstermateriaal te concentreren.
De gedissocieerde cellen kunnen uit de buis worden verwijderd door te pipetteren door de septumverzegelde dop van de C-buis. Met behulp van een geschikte 1000 microliter pipettetip wordt de celsuspensie op de celzeef aangebracht om grotere deeltjes of aggregaten te verwijderen. Zodra de oplossing is uitgelopen, spoelt u de celzeef door nog eens vijf milliliter kamertemperatuur en hees-buffer toe te voegen om de gefilterde cellen te pellen.
Centrifugeer de 50 milliliterbuis gedurende 10 minuten bij 300 GS. Zuig nu de supernatant op en suspendeer de cellenpellet in uw gewenste volume kamertemperatuur. PEB-buffer.
Decanteer het supernatant niet. U kunt nu doorgaan naar uw downstream-toepassing. Dissociatie van muislongweefsel met behulp van deze procedure zal een hoog percentage levensvatbare leukocyten en endotheelcellen opleveren.
De verkregen enkele celsuspensies werden gekleurd met CD 45 PE als CD 1 46 FITC, of CD 31 FITC, en geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Deze plot toont de verrijking van dendritische cellen met behulp van CD 11 C microbeads, een minimax-scheider en twee MS-kolommen. Oké. Ik heb je zojuist laten zien hoe je op een gestandaardiseerde manier enkele celsuspensies uit muislongweefsel bereidt door gebruik te maken van de Gentle Mix dissociatie en C-buizen.
Deze methode maakt een efficiënte en gen-weefseldissociatie mogelijk. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de long goed te dissecteren en het weefsel direct na dissectie te verwerken. De bereide enkele celsuspensies kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere experimenten.
Bijvoorbeeld, de magnetische markering van de cellen, en vervolgens de scheiding van leukocyten of endotheelcellen. Oké, dat is alles. Bedankt voor het bekijken en veel succes met je experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit videoprotocol demonstreert de dissociatie van longweefsel van volwassen muizen met behulp van de gentleMACS dissociator. De procedure is ontworpen om een groot volume levensvatbare, kweekbare cellen te produceren voor verdere toepassingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Cel-dissociatietechnieken
- Bereiding van een single-cell suspensie
- Analyse van longweefsel van muizen
Achtergrond
- Het dissocieren van cellen uit weefsels vereist specifieke parameters.
- De gentleMACS dissociator biedt een geoptimaliseerd protocol.
- Collagenase D en DNase worden gebruikt in het dissociatieproces.
- Gefilterde cel-suspensies worden klaargemaakt voor verdere toepassingen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode aan te tonen voor het bereiden van enkelcel-suspensies.
- Om de studie naar leukocyten en endotheelcellen te faciliteren.
- Om een praktisch protocol te bieden voor onderzoekers in het vakgebied.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een gentleMACS-dissociator voor weefselagitatie.
- Toepassing van collagenase D en DNase tijdens de dissociatie.
- Filtratie van cel-suspensies door een celzeef van 70 micron.
- Centrifugatie en suspensie van cellen voor verdere toepassingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle dissociatie van longweefsel van muizen tot enkelcel-suspensies.
- Hoge opbrengst aan levensvatbare, kweekbare cellen.
- Protocol demonstreerde reproduceerbaarheid en efficiëntie.
- Preparatie geschikt voor downstream toepassingen.
Conclusies
- De gentleMACS-dissociator is effectief voor de dissociatie van longweefsel.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende weefseltypen.
- Biedt een waardevolle tool voor onderzoekers die longweefsel bestuderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Gestandaardiseerde weefseldissociatie is een cruciale eerste stap in onderzoek naar immunologie en vasculaire biologie, waardoor reproduceerbare bereiding van primaire celsuspensies voor downstream-analyse mogelijk wordt. De gentleMACS Dissociator biedt een geautomatiseerde, zachte en schaalbare methode voor het genereren van single-cell suspensies met een hoge levensvatbaarheid uit longweefsel van muizen, wat zorgt voor een consistente input voor flowcytometrie, celsortering en moleculaire profilering. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in target-validatiestudies door de variabiliteit in cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid tussen experimenten te verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om leukocyten- en endotheelcelpopulaties in longweefsel te onderzoeken voor het testen van doelgerichte hypothesen.
- Operationele waarde: Vermindert handmatige variabiliteit bij de weefselverwerking, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdstippen wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt een consistente cellulaire input voor flowcytometrie en sortering, wat het vertrouwen in de resultaten van fenotypische screening verhoogt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gefilterde, debrisvrije suspensies die geschikt zijn voor antilichaamkleuring en flow-gebaseerde assays.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde enzymatische digestie en mechanische dissociatie waarborgen de consistentie van de celopbrengst tussen verschillende batches.
- Assay-gereedheid: Genereert suspensies die compatibel zijn met downstream-applicaties zoals magnetische labeling en celseparatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekterelateerd systeem voor het bestuderen van immuun- en vaatceldynamiek in longweefsel.
- Ondersteuning van preklinische modellen: Maakt de isolatie van primaire cellen uit muizenlongen mogelijk voor mechanistische risicoreductie van therapeutische doelwitten.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Betrouwbare celpreparatie ondersteunt consistente biomarkeranalyse en functionele validatie in preklinische workflows.
Integratie van Pipeline & Workflow
De gentleMACS Dissociator past in de discovery-workflow als een gestandaardiseerde stap voor monstervoorbereiding tussen het oogsten van weefsel en de cellulaire analyse, waardoor een betrouwbare overgang van ex vivo weefsel naar analyseklare enkelcellen mogelijk wordt gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde isolatie van immuun- en stromale cellen in de longen voor pad-analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare cel-suspensies voor high-content of flow-gebaseerde fenotypische screening van immuunmodulatoren.
- Analytica: Maakt kwantitatieve flowcytometrie-uitlezingen mogelijk (bijv. CD45+, CD31+) voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt murine longmodellen met mens-relevante immuun- en endotheelcelstudies via gestandaardiseerde preparatie.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het voorgeprogrammeerde longprotocol van het instrument maakt hergebruik mogelijk in projecten die pulmonale ontsteking, fibrose of infectie bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid van leukocyten en endotheelcellen verhogen de datakwaliteit in downstream-applicaties.
- Operationele waarde: Automatisering vermindert de hands-on tijd en de gebruikersafhankelijke variabiliteit bij weefseldissociatie.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van consistente cellulaire opbrengsten en metrics voor levensvatbaarheid.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets door betrouwbare primaire cel-inputs voor validatie te leveren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist training in aseptische weefseldissectie en enzymatische behandeling.
- Afhankelijk van toegang tot een gentleMACS Dissociator met een longspecifiek programma en C-buizen.
- Vereist standaardisatie van enzymconcentraties (Collagenase D, DNase) en buffercondities tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende muisstammen, leeftijden of ziektebeelden die de weefseldichtheid beïnvloeden.
- Beperkt tot weefsels die compatibel zijn met enzymatische dissociatie; mechanische alternatieven kunnen nodig zijn voor fibreuze of verkalkte monsters.
