Name: Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer gametogenese en paring van Chlamydomonas reinhardtii voor genetische analyse. Deze methode omvat inductie van gameten, zygootkieming en viertalscheiding om erfelijkheidsonderzoek te vergemakkelijken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol is gebaseerd op technieken geleerd in het laboratorium van Francis-Andre Wollman aan het Institut de Biologie Fysisch-Chimique, Parijs, Frankrijk. De auteurs danken een schuld van dankbaarheid aan Jacqueline Girard-Bascou, die oorspronkelijk DBS geïntroduceerd om Chlamydomonas genetische technieken. Chlamydomonas onderzoek in het auteurs &#39;laboratorium wordt ondersteund door de National Science Foundation Award MCB-0646350.

Deel 1: Voorbereiding van de stammen voor gametogenese Opmerking: Alle handelingen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Hogere of lagere temperaturen hebben invloed op de snelheid van de zygote kiemen en kan negatieve invloed hebben op levensvatbaarheid. Belangrijke overweging: Het is essentieel dat de stammen worden gedekt robuuste groeien en zijn vrij van besmettelijke schimmels of bacteriën. Als de stammen niet op regelmatige wijze overgedragen, moeten passage op rijk medium voorafgaan generatie van gameten. <ol><li> Stammen worden gedekt worden overgebracht naar TAP platen (100 × 15 mm), 1-2 stammen per plaat. De cellen moeten worden gekweekt in een geconcentreerde strip ongeveer 1 cm in de breedte. </li><li> Incubatie op TAP borden moeten blijven tot er een dikke laag van robuust-groeiende cellen aanwezig is, met tussentijdse transfers indien nodig. Stammen die niet onlangs zijn gepasseerd kunnen een passage en een totaal van 1 week, terwijl de wild-type stammen die regelmatig gebruik kan slechts een paar dagen en geen passages. Mutanten die lichtgevoelige wellicht meer tijd nodig. </li><li> Breng alle cellen van het TAP platen aan N10 platen, die deficiënt zijn voor stikstof en zal beginnen te gametogenese induceren. Overdracht van de cellen als een dikke plaat, zoveel als ze aanwezig waren op de TAP-plaat. Dit zal de daaropvolgende verzameling van de cellen. Na 3 dagen op de N10, worden de cellen bereid om gametogenese ondergaan. Celdeling zal langzaam op de N10, maar cellen moeten donker groen blijven. Besmette stammen moeten worden weggegooid als levensvatbare zygoten zullen niet worden verkregen. </li></ol> Deel 2: Mating <ol><li> Elke stam is overgebracht in een 50 ml Erlenmeyer hermetisch en geresuspendeerd in ongeveer 2,5 ml steriel gedistilleerd water. Dit kan worden gedaan hetzij met behulp van een draad lus of een steriele stok, wat belangrijk is, is dat de cellen goed zijn opgehangen en niet in groepjes. Het exacte volume van het water dient te worden aangepast, zodat de cel concentratie, zoals gemeten door het oog, is ongeveer hetzelfde voor elke stam. </li><li> Cellen worden onrustig bij fel licht (1.260 μ E / m 2 / sec) gedurende 2 uur, gedurende welke tijd de cellen zullen worden beweeglijke gameten. Beweeglijkheid moeten worden gecontroleerd onder een lichtmicroscoop. Als de gameten slecht zwemmen, paring is waarschijnlijk inefficiënt. Toch zal zelfs slecht beweeglijke stammen mate een verminderde frequentie. </li><li> Vervolgens gelijke volumes mt + en MT-gameten worden gecombineerd in een enkele 50 ml kolf. Gameten worden gelaten bij fel licht (1.260 μ E / m 2 / sec) zonder agitatie. </li><li> Paring kan direct worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop. Paren van gameten vorm snel en wordt weergegeven als snel bewegende cellen zich op de flagellen. Als dekking blijkt te zijn extreem snelle, moeten regelmatig monsters worden genomen binnen 30 min -1 uur voor het genereren van zygoten. Zo niet, dan kan dekking worden gecontroleerd elk uur, maar dit is optioneel. Sinds keer waardoor de optimale dichtheid van zygoten zal sterk variëren tussen de kruizen, is het het beste om aliquots van de dekking mengsel te nemen op verschillende momenten na het combineren van gameten, bijvoorbeeld na 1 uur, 2 uur, 3 uur en 4 uur. Dit wordt gedaan door de overdracht van 300 il monsters aan TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm platen; 3-4 spots per plaat. Wees voorzichtig dat u de paring mengsel roeren, dit kan verstoren paring paren. Difco agar wordt gebruikt omdat het minder verontreinigingen dan lager geprijsde agars, en het zal gemakkelijker zijn om zygoten te zien onder de microscoop. De ongebruikte paren mengsel kan worden achtergelaten in de kolf &#39;s nachts, en de kwaliteit van de dekking reactie zal duidelijk zijn de volgende dag. Tijdens de paring efficiënt is, zal de zygoten hechten aan de wand of bodem van de kolf en het medium zal er helder. Zelfs agitatie van de kolf zullen voldoen aan de zygoten verjagen. Als er niets kleeft aan het glas als het mengsel wordt geschud met een redelijke kracht, dan is de paring was inefficiënt of niet heeft plaatsgevonden. </li><li> De TAP-Difco platen met paring mengsel worden gedroogd in een steriele kap, met de deksels op een kier, tot elk oppervlak vloeistof is geabsorbeerd. De platen zijn meestal nog in het licht (700 NE / m 2 / sec) voor 18 uur, daarna verpakt in folie, omdat zygospore rijping zal alleen plaatsvinden in het donker. De stammen gekruist, paring tijd en datum zijn geschreven op zowel de platen en de folie. Platen zijn opgeslagen 5 tot 7 dagen en kunnen langer bewaard worden, hoewel zygote kieming efficiëntie daalt geleidelijk. </li></ol> Deel 3: Viertal Dissection <ol><li> Vegetatieve cellen moet worden afgeschraapt gedroogde plekken van de paring mengsel met behulp van een bot mes, zoals een scalpel. Het blad kan worden gebruikt om een ​​gebied van zygoten, die strak zal houden aan de 3% agar bloot te leggen. Deze stap gebeurt meestal in de middag, zodat de zygoten ontkiemd zijn door de volgende ochtend, maar hebben niet ondergaan een seconde, vegetatieve divisie die zoudenopbrengst acht nakomelingen. Chlamydomonas biologen snel leren te herkennen zygoten onder de microscoop, omdat ze groter zijn dan vegetatieve cellen, en zijn voorzien van een dikke zygospore muur die een zwarte rand geeft. Zygospores lijken vaak geel, maar kan ook een beetje groen. Het belangrijkste personage is dat zij zich aan agar, terwijl de vegetatieve cellen zijn gemakkelijk opzij verplaatst. Echter, als de platen al te droog zal dit niet het geval. Ook, indien de paring mengsel was te dicht, kan zygoten vormen een mat waardoor de overdracht van individuele zygoten moeilijk of onmogelijk. Juiste dichtheid zijn gevestigd in stap 2.1, en zal snel te leren met ervaring. </li><li> Glazen naalden zijn voorbereid voor het verzamelen van zygoten en het scheiden van tetrade nageslacht. Deze worden bereid door te trekken 3 mm glazen staven in een kleine vlam op een lange, dunne draad, die kan worden afgebroken te genereren. De toppen van deze taps toelopende uiteinden zijn gladgestreken of gebogen in haken, door korte verhitting in een lage vlam (bijv. alcohol of een brandende lucifer). Bereid drie of meer glazen naalden, want ze breken vrij gemakkelijk, vooral voor onervaren gebruikers. </li><li> Zygoten zijn verzameld op de 3% TAP-Difco plaat met een glazen naald in een kleine stapel. Een vierkant van agar (tot 0,5 cm 2) met de zygoten is gevormd en weggesneden met behulp van een scalpel saai. Daarna wordt de agar blok gelegd naar beneden op een 15 mm 1.5% TAP-Difco plaat, en gleed langs een horizontale lijn ongeveer 1,5 cm van de bovenkant van de plaat, om de zygoten te verdelen. De bovenste horizontale lijn, en een grid met ongeveer 1,5 cm en 0,5 cm horizontale verticale afstand worden geëtst in de achterkant van de platen. Het raster wordt gebruikt de volgende dag als een leidraad voor het scheiden van het viertal nageslacht (het rooster kan ook worden geëtst op de dag van dissectie). Tot slot zijn individuele zygoten te verplaatsen naar de snijpunten van de bovenste horizontale lijnen met elke verticale lijn, met ongeveer 20-30 zygoten per plaat. Hoewel slechts 12 of zo zal worden ontleed, niet elke zygote ontkiemt, en sommigen zullen twee keer verdelen vóór het barsten, worden dus extra zygoten nodig is. </li><li> Na het verdelen van de zygoten, en vegetatieve cellen die per ongeluk zijn overgedragen van de 3% agarplaat worden gedood door het blootstellen van de omgekeerde plaat gedurende 30 seconden via een glazen schaal met daarin een dunne (1-2 mm) laag van chloroform. De afstand tussen de plaat en chloroform moet ongeveer 5 cm. Als er te veel chloroform wordt gebruikt, of als de afstand te klein of groot, een risico of het doden van de zygoten, of niet het doden van de vegetatieve cellen. De chloroform behandeling moet onmiddellijk worden gedaan nadat de zygospores zijn verdeeld over de kieming plaat, om de selectiviteit te garanderen. </li><li> Kieming duurt 16-20 uur voor de meeste stammen, maar zal variëren met genotype en met de leeftijd van de zygoten. Voor de kieming, worden de platen onder weinig licht (239 NE / m 2 / sec), of in middelgrote licht gedimd door het bedekken van de plaat met een tissue. </li><li> Gekiemde zygoten kunnen worden geïdentificeerd onder de microscoop als gezwollen of soms barsten cellen met dochter cellen binnen hen. Als de zygospore nog niet verbroken, zal zachtjes aanraken met een glazen naald breken de muur als kieming heeft plaatsgevonden. Dochter cellen worden voorzichtig gesleept om het raster punten onder de zygote. Het is het makkelijkst om dit te doen door het vastleggen van de cel in een kleine hoeveelheid vloeibaar medium vrijkomt uit de agar door de druk van het glas naald, en slepen deze &quot;plas&quot; achter de naald. Een vorm van &quot;verzekering&quot; dat men een zygote en niet een vegetatieve cel die twee keer heeft verdeeld ontleed, is dat, afgezien van de vier dochter cellen, zal de &quot;huid&quot; van de zygospore muur blijven. </li><li> De nakomelingen ontleed worden geteeld onder de juiste omstandigheden tot zichtbaar clonies kan worden opgehaald voor verdere analyse. Platen moet dagelijks worden gecontroleerd op besmetting. </li></ol> Let op: Het genereren van vegetatieve diploïden is hier niet behandeld, maar in wezen gaat om plating de paring mengsel op medium dat niet de groei van een van beide ouders stam, maar zal de groei van de diploïde (bijv. twee verschillende auxotropic markers) te ondersteunen. Platen zijn bewaard in het licht van de vorming van zygoten te voorkomen.

<ol><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Genetische analyse is eenvoudig in Chlamydomonas, maar het vereist specifieke technieken voor het genereren van gameten en aparte tetrade nageslacht. Met een gezonde stammen, zijn de technieken gemakkelijk verworven. Bij sommige mutante stammen, wordt het meer een kunst, en lezers moeten Volume 1 refereren aan de onlangs gepubliceerde Chlamydomonas bronnenboek voor historische notities en praktische tips. Bovendien moet worden opgemerkt dat er vele variaties op het basisthema hierboven beschreven, vari...

<table><tbody><tr><td>CC-125</td><td>Paringsstype &lt;em&gt;plus&lt;/em&gt; stam</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-124</td><td>Paringsstype &lt;em&gt;minus&lt;/em&gt; stam</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP)</td><td>Groeimedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N10</td><td>Groeimedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand roestvrijstalen mesjes</td><td>Instrumenten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>BD chirurgische scalpelhouders</td><td>Instrumenten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-914-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand metalen scalpels</td><td>Instrumenten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-920A</td><td></td></tr></tbody></table>

paring en viertal scheiding van chlamydomonas reinhardtii voor genetische analyse

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

De eencellige groene alg<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Is uitgegroeid tot een populaire organisme voor het onderzoek in diverse gebieden van de celbiologie en genetica vanwege zijn eenvoudige levenscyclus, het gemak van de groei en manipulatie voor genetische analyse, genomische middelen en transformability van de kern en beide organellen. Paring stammen is een gangbare praktijk bij het genetische benaderingen worden gebruikt in<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Om vegetatieve diploïden te creëren voor de analyse van dominantie, of na tetrad dissectie om na te gaan nucleaire vs organellar erfenis, tot allelism te testen, om te epistasy analyseren, of om de bevolking voor het doel van de kaart op basis van klonen te genereren. Daarnaast worden genetische kruisen routinematig gebruikt om organellar genotypen te combineren met het bijzonder nucleaire genotypes. Hier laten we zien standaard methoden voor gametogenese, paring, zygote kieming en tetrade scheiding. Dit protocol bestaat uit een gemakkelijk te volgen reeks van stappen die ervoor zorgt dat genetische benaderingen vatbaar is voor wetenschappers die minder bekend zijn met<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Belangrijke parameters en knelpunten worden toegelicht. Tot slot worden de middelen voor verdere informatie en alternatieve methoden.

Paring en tetrade scheiding nodig zijn voor genetische analyse in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Hier laten we zien standaard methoden voor gametogenese, paring, zygote kieming en tetrade dissectie. Dit protocol bestaat uit een gemakkelijk te volgen reeks van stappen die ervoor zorgt dat genetische benaderingen vatbaar is voor wetenschappers die minder bekend zijn met<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

De eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) is een populair organisme geworden voor onderzoek in diverse gebieden van de celbiologie en ...

Chlamydomonas is een eencellige groene alg die zich onder ideale groeicondities aseksueel deelt. Wanneer de condities verslechteren, treedt het organisme in een cyclus van seksuele reproductie. Gametogenese kan worden geïnduceerd door stammen over te brengen van TAP-agar naar stikstofarme agar; 10 agarcellen worden vervolgens resuspendeerd en geschud onder sterk licht om modale MT-plus en MT-minus gameten te genereren, die vervolgens in één kolf worden gecombineerd voor paring. Monsters worden op een TAP-agarplaat geplaatst en belicht, en daarna in folie gewikkeld voor de rijping van zygotes.Na vijf tot zeven dagen worden de vegetatieve cellen afgeschraapt, waardoor de zygoten vrijkomen die stevig aan de boor vastzitten. Deze worden overgebracht naar TAP DCO-platen voor kieming. Onder zwak licht worden de tetraden vervolgens gescheiden en gekweekt onder passende condities.Zodra er zichtbare klonen verschijnen, kunnen deze worden opgepikt voor verdere analyse. Hallo, ik ben David Stern, president van het Boy Thompson Institute for Plant Research. Vandaag laten we u de procedures zien voor paring en tetra-dissectie voor de modelgroenalgensoort Chlamydomonas reinhardtii.Veel laborator

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads door fluorescentie-geactiveerde celsortering op agarplaten, scheidt de sporen door roeren met glaskralen, en bepaalt welke willekeurig bekleed kolonies afgeleid van dezelfde oorspronkelijke viertal behulp van moleculaire barcodes.

BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Temperatuurgevoelige (ts) letale mutanten zijn waardevolle hulpmiddelen om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Hier beschrijven we methoden om ts letale mutanten op grote schaal te genereren en te classificeren.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

We hebben een strategie om te zuiveren en het beeld van een groot aantal centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor super-resolutie microscopie en single-deeltje gemiddeld ontwikkeld.

Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.

Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

De in vitro reactivering van beweeglijke cellen is een cruciaal experiment in het begrijpen van de mechanismen van celmotiliteit. Het protocol beschrijft het reactiveren van de gedemembraneerde celmodellen van Chlamydomonas reinhardtii, een modelorganisme om trilharen/flagellen te bestuderen.

Reactivering van gedemembraneerde celmodellen in Chlamydomonas reinhardtii

De meeste zwemmende fotoautotrofe organismen vertonen foto-geïnduceerde gedragsveranderingen (fotogedrag). Het huidige protocol observeert het genoemde fotogedrag in het modelorganisme Chlamydomonas reinhardtii.

Observatie van Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Leer gametogenese en paring van Chlamydomonas reinhardtii voor genetische analyse. Deze methode omvat inductie van gameten, zygootkieming en viertalscheiding om erfelijkheidsonderzoek te vergemakkelijken.

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

Meer video's verkennen