Batch Immunokleuring Grootschalige eiwitdetectie in de Whole Brain Monkey
27 juli 2009
Grootschalige immunodetectie van target eiwitten in het hele primaat hersenen is mogelijk door het gebruik van nieuwe weefsel inbedden en snijden methoden gecombineerd met het gebruik van creatieve apparatuur voor batch kleuring van meerdere vrij zwevende delen op een gegeven moment.
Deze procedure begint bij ontvangst van een 4%PFA geperfundeerde, geëxternaliseerde en cryobeschermde hersenen, die naar Neuroscience associates is gestuurd voor inbedding met behulp van inbeddingslandmerken die in de omringende matrix zijn ingebed. De hersenen kunnen in het coronale vlak worden gesneden om seriële secties met een gewenste dikte te produceren, die de volledige anterieure posterieure omvang van de hersenen zullen vertegenwoordigen met behulp van gespecialiseerde manden en containers. Batch immunoverwerking kan worden uitgevoerd om het ruimtelijke expressiepatroon van een eiwit door de hele hersenen te bepalen.
Hallo, ik ben Dr. Shaheen Zur van het Visual Neurosciences Laboratory in de School of Optometry aan de Universiteit van Montreal. Hallo, ik ben Dr. Mark Burke, ook van het Visual Neurosciences Laboratory in de School of Optometry aan de Universiteit van Montreal. Hallo, ik ben Dr. Mo Petto, directeur van het Visual Neuroscience Laboratory aan de School of Optometry, universiteit van Montreal.
Vandaag laten we u een procedure zien voor batch immunokleuring voor grootschalige eiwitdetectie in een hele aapshersen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de expressiepatronen van doeleiwitten in de hele hersenen te bestuderen en om de expressie van die eiwitten binnen dezelfde hersenen te vergelijken en contrasteren. Dus laten we beginnen.
Voorafgaand aan histologische verwerking, verkrijgt u een primatehersen die is bewaard via systemische perfusie en postfixatie en cryobeschermd met behulp van gegradeerde sucrose-oplossingen. In dit stadium wordt de hersenen naar neuroscience associates gestuurd om ingebed te worden en vrij gesneden met behulp van hun eigen technologie. Bij terugkeer zal men zien dat er zeven uitlijningslandmerken in de inbeddingsmatrix zijn geplaatst, zodat de secties na voltooiing van de histologische verwerking goed kunnen worden georienteerd en opnieuw uitgelijnd.
Tijdens het snijden worden digitale beelden gemaakt die later kunnen worden gebruikt voor 3D-reconstructie van anatomische kaarten. Neuroscience associates verwerkt ons weefsel om seriële 50 micrometer dikke vrij drijvende coronale secties over de hele hersenen op te leveren. Eenmaal voltooid, kunnen we beginnen met histologische verwerking van de secties.
Wanneer we beginnen met histologische verwerking, hebben we meestal ongeveer 140 secties te verwerken per antilichaam of kleurstof. Hier zullen we de techniek demonstreren met een kleinere steekproef van secties behandeld met het antilichaam SMI 32, een monoklonaal antilichaam tegen niet-gefosforyleerde neurofilamenteiwitten. Gedurende de procedure worden gespecialiseerde kleurkommen en manden gebruikt, waardoor een groot aantal vrij drijvende secties tegelijkertijd en efficiënt kan worden verwerkt.
Dit zorgt ervoor dat de resulterende kleur consistent is over alle secties. De eerste stap is om de secties gedurende 60 minuten te incuberen in een PBS-gebaseerde oplossing die TRITTON X 100 en normaal paardenserum bevat. Dit zal de niet-specifieke binding van antilichaammoleculen die resulteert in achtergrondkleuring verminderen.
Vervolgens worden de secties een nacht ingecubeerd. In een PBS-gebaseerde SMI 32-antilichaamoplossing, aangevuld met tritton X 100 en normaal paardenserum, worden de secties de volgende dag drie keer gedurende 10 minuten in wasoplossing gewassen en vervolgens twee uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. In een PBS-gebaseerde biotinyleren Muse secundaire antilichaamoplossing die Triton X 100 en normaal paardenserum bevat.
Na een reeks van drie extra 10 minuten wasbeurten, worden de secties gedurende een uur bij kamertemperatuur in een oplossing van avadon biotin-geconjugeerd mierikswortelperoxidase complex geplaatst. Ten slotte, na nog een reeks wasbeurten, worden de secties gedurende 10 minuten in een D-aminobenzeenreactie geplaatst, die een bruine kleuring produceert binnen de immunoreactieve neuronen. De reactie wordt vervolgens gestopt door de kleuringsmand te verwijderen en de secties in PBS te dompelen.
Na twee tot drie, vijf minuten spoelen in PBS zijn de secties klaar om individueel op glasplaatjes te worden gemonteerd om het montageproces te beginnen met behulp van een grote petrischaal en zeer zachte verfkwasten. Secties worden uit de PBS-buffercontainer opgehaald en individueel op gelatine-gecoate glasplaatjes gemonteerd. De monsters worden vervolgens overnacht in een afzuigkap laten drogen de volgende dag.
De secties worden gespoeld door ze in gedeïoniseerd water te dompelen om eventuele zoutkristallen die overblijven van het montageproces te verwijderen. De plaatjes worden vervolgens gedehydrateerd in gegradeerde ethanolstappen, schoongemaakt in xyleen en afgedekt met permount montagemedium. In dit stadium moeten de plaatjes ongeveer een week tot 10 dagen in horizontale positie worden bewaard om het montagemedium te laten harden.
Daarna kunnen de plaatjes worden bewaard in een plaatjesdoos of worden onderworpen aan beeldvorming via microscopie. Deze methode produceert een volledig expressieprofiel van een doeleiwit van belang over een hele aapshersen. Hier laten we representatieve coronale secties zien die een momentopname bieden van FMRP, new n en SMI 32 expressie.
In dezelfde aapshersen. We hebben u zojuist laten zien hoe u batch immunokleuring voor een doeleiwit van belang over de hele hersenen kunt voltooien. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle secties lichtjes worden geagiteerd terwijl ze worden geïncubeerd in verschillende oplossingen, en dat ze te allen tijde volledig ondergedompeld blijven.
Neem bovendien de tijd tijdens het glasmonteren van de dissecties en verwijder zoveel mogelijk rimpels en plooien zonder de integriteit van het weefsel te beschadigen. Dus dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt een nieuwe aanpak voor grootschalige immunodetectie van doelwitteiwitten in de hersenen van primaten. Het benadrukt innovatieve methoden voor weefselinsluiting en -snijden, samen met batchkleuringstechnieken voor meerdere vrij zwevende secties.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Immunodetectie
- Hersenbeeldvorming
Achtergrond
- Immunodetectie is cruciaal voor het bestuderen van eiwitexpressie in de hersenen.
- Traditionele methoden kunnen beperkt zijn in omvang en efficiëntie.
- Vooruitgang in weefselverwerkingstechnieken kan de onderzoekscapaciteiten verbeteren.
- Batchverwerking maakt een uitgebreide analyse van eiwitverdeling mogelijk.
Doel van de studie
- Om methoden te ontwikkelen voor grootschalige immunodetectie in primatenhersenen.
- Om de efficiëntie van eiwitexpressie-analyse te verbeteren.
- Om de studie van ruimtelijke expressiepatronen in de hersenen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- 4% PFA perfusie voor hersenbehoud.
- Insluiting met behulp van uitlijningslandmerken in een omringende matrix.
- Snijden op het coronale vlak voor seriële secties.
- Batch immunoverwerking voor ruimtelijke eiwitexpressie-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle insluiting en snijden van hersenweefsel van primaten.
- Aangetoonde mogelijkheid om eiwitexpressiepatronen te analyseren.
- Innovatieve technieken verhogen de efficiëntie van immunodetectie.
- Mogelijkheid voor bredere toepassingen in neurowetenschappelijk onderzoek.
Conclusies
- De ontwikkelde methoden verbeteren grootschalige immunodetectie aanzienlijk.
- Deze technieken kunnen ons begrip van eiwitexpressie in de hersenen bevorderen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwend op deze methoden voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
