Name: Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer de zuivering en cultuur van menselijke eilandjes van Langerhans via een gemodificeerde geautomatiseerde methode. Dit protocol zorgt voor hoogwaardige eilandjes voor klinische transplantatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door de oprichting van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie ​​(RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.

1. Zuivering van eilandjes <ol><li> Om te beginnen het eilandje zuivering procedure, laadt u de COBE zak, klem alle buizen, behalve de groene buis, en zet de snelheid op 1500 en de super uit op 0. </li><li> In de kap het opzetten van de pomp en de gradiënt bekers en sluit de collectie slang aan op de groene buis. </li><li> Nu het laden van de Ficoll 1.100 kan beginnen: druk op &quot;spin&quot; dan 110 ml Ficoll 1.100 toe te voegen aan de voorkant beker, en start de pomp om de COBE zak te laden. Omdat de Ficoll is geladen, drukt u op super uit, stop de pomp, ontspan de pomp hoofd en zet de super uit snelheid naar 100. </li><li> Wanneer de Ficoll de beker bereikt en alle lucht uit de slang, re-klem aan de pomp hoofd. Stel het toerental tot 3000, en de super uit snelheid naar 0. </li><li> Nu voor te bereiden op de hellingen belasting door het gieten van de zware helling in de voorkant beker. Iets laat de klem tussen de twee bekers om de lucht te verwijderen. Giet vervolgens het licht helling in de rug beker. </li><li> Zet de magneetroerder, drukt u op &quot;spin&quot; op de COBE machine, verwijder de klem van de buis die de twee bekers, en visueel te controleren of de zware en lichte hellingen zijn mixen. </li><li> Zodra de hellingen begonnen met het mengen, zet de centrifuge. Wacht een minuut, en zet vervolgens de pomp aan het mengen gradiënten te laden. </li><li> Voor het laden van het weefsel laat de gradiënt lage uitgevoerd in de front beker, maar niet laag genoeg zodat de lucht naar de laad-buis in te voeren en Span de buis die de bekers en de belasting van het weefsel. </li><li> Ga door het toevoegen van de rest van het weefsel. Was daarna de buis die het weefsel gehouden met 50 ml wasoplossing, en gebruik deze om de voorkant beker te wassen. </li><li> Als laatste van het weefsel komt in de zak, stop tegelijkertijd de pomp, ontspan aan de pomp hoofd, en klem slangen boven de zak. Blijf centrifuge gedurende 5 minuten. </li><li> Tijdens het centrifugeren blijft, brengt de 12 collectie buizen aan de motorkap en los te maken van hun petten. Bevestig de collectie slang aan op de gele buis, en plaats de steriele collectie punt in een conische buis. Dan ontspan de gele buis, en klem de groene buis. </li><li> Wanneer de spin is afgelopen, langzaam verhogen Superout tot 100. Verzamel 150 ml in een buis. Dan verzamel 30 ml in tubes 2-12 (200-230 ml). </li><li> Zodra collectie is compleet, druk op &quot;STOP&quot; op de COBE. Nu dat zuivering is beëindigd, kan de eilandjes worden beoordeeld en gekweekt. </li></ol> 2. Sampling en cultuur <ol><li> Na het verzamelen van de gezuiverde fracties eilandjes, verwijderen van een monster uit elk van de twaalf collectie buizen en vlek met Dithizone. De kleuring zal blijken welke lagen bevatten hoge zuiverheid eilandjes vs lagen met een lage zuiverheid eilandjes. </li><li> Verzamel de hoge en lage zuiverheid weefsel en het zwembad elke samen. </li><li> Spin en was twee keer. Na de tweede wasbeurt, breng het volume van elk 250 ml met Final Wash media. </li><li> Voor de beoordeling van de verzamelde fracties te beginnen door het nemen van twee 1 ml monsters van het hoogtepunt van de samengevoegde fracties en een 1 ml monster uit de laag. Overdracht elk 1ml monster in een conische buis met 9 ml wasoplossing. </li><li> Dan breng 1 ml van elk 15 ml buis tot een tellen schotel. Onderzoek en tellen van de cellen onder de microscoop. </li><li> Na het tellen van de cellen te berekenen van het aantal kolven nodig is om de cultuur van de eilandjes met de volgende formule: (totaal EIN / zuiverheid van de eilandjes in decimalen) / (30000 EIN per fles). Bijvoorbeeld, zijn 100.000 eilandjes met 90% zuiverheid gekweekt in vier kolven. </li><li> Breng de eilandjes voor T175 kolven en cultuur in een 37 ˚ C en 5% CO 2 incubator. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de technieken van de menselijke eilandje isolatie, eilandje opbrengst blijven zeer variabel en onvoorspelbaar. Zuivering van verteerd pancreas weefsel is van cruciaal belang om voldoende massa eiland te herstellen na de succesvolle enzymatische vertering voor transplantatie. De UIC zuiveringsmethode is aanbevolen omdat een superieur herstel van zeer zuivere menselijke eilandjes werd aangetoond met behulp van deze methode. Bovendien kan tot 50 ml van verteerd weefsel worden geladen ...

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>apparatuur</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 Cell Processor</td><td>apparatuur</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>isletpurificatie</td></tr><tr><td>MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td><td>apparatuur</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekschaal met 2 mm raster</td><td>apparatuur</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>islettellen</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>apparatuur</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBE-zak</td><td>wegwerpmateriaal</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175 kweekfles</td><td>wegwerpmateriaal</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin (UW) oplossing</td><td>reagens</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s gebufferde zoutoplossing (HBSS)</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>reagens</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium (wasoplossing)</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Finale was/kweekmedium</td><td>reagens</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

human eilandjes van langerhans isolatie: deel ii: zuivering en cultuur van de mens eilandjes

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes<sup&gt; 1</sup&gt;, Zonder het risico van ernstige hypoglycemische episodes die geassocieerd worden met intensieve insulinetherapie. Zorgen voor voldoende eilandje massa is van belang voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. Echter, donor kenmerken, orgaanverkrijging en het behoud van invloed op de uitkomst isolatie<sup&gt; 2</sup&gt;. Aan de Universiteit van Illinois in Chicago (UIC) ontwikkelden we een succesvolle isolatie protocol met een verbeterde zuivering gradiënt<sup&gt; 3</sup&gt;. Het programma is gestart in januari 2004 en meer dan 300 isolaties werden uitgevoerd tot en met november 2008. De pancreata werden in koude behoud oplossingen (UW, Universiteit van Wisconsin-of HTK, Histidine-tryptofaan Ketoglutaraat)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Om de Cell Isolatie Laboratory van UIC voor eilandje isolatie. Pancreaseilandjes werden geïsoleerd met behulp van de UIC-methode, die is een gewijzigde versie van de methode die oorspronkelijk beschreven door Ricordi<em&gt; Et al.</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Zoals beschreven in deel I: Spijsvertering en verzamelen van alvleesklierweefsel, was de menselijke pancreas getrimd, gecanuleerde, doorbloed, en verteerd. Na het verzamelen en ten minste 30 minuten incubatie in UW oplossing, was het weefsel dat in de cel scheidingsteken (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) voor de zuivering<sup&gt; 3</sup&gt;. Na de zuivering, eilandje rendement (uitgedrukt in eilandje-equivalenten, IEQ), weefsel volume en zuiverheid werd bepaald volgens standaardmethoden<sup&gt; 9</sup&gt;. Geïsoleerde eilandjes werden gekweekt in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), aangevuld met 1,5% humaan albumine, 0,1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 1 ml van Ciprofloxacine, 5 ml 1M HEPES, en 14,5 ml van de 7,5% natriumbicarbonaat in T175 kolven bij 37 ° C gedurende de nacht cultuur voordat eilandjes getransplanteerd werden of worden gebruikt voor onderzoek.

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Het beheer van diabetes type 1 is belastend, zowel voor het individu als voor de maatschappij, met jaarlijkse kosten van meer dan 100 miljard dollar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van ...

In deze video wordt pancreasweefsel dat eerder is geïsoleerd en verteerd, onderworpen aan zuivering via een gradiënt, wat resulteert in een gezuiverde fractie pancreaseilandjes die uiteindelijk in weefselkweekflesjes kunnen worden gekweekt tot aan de transplantatie. Hallo, ik ben American Chief van het Lab of Human Eyelets Program in de afdeling Chirurgie aan de University of Illinois in Chicago. Hallo, mijn naam is Barbara Barbero en ik maak ook deel uit van het Human Eyelet Program.Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie van menselijke pancreaseilandjes. Wij gebruiken deze procedure in onze faciliteit om menselijke eilandjes van hoge kwaliteit te winnen voor klinisch gebruik. Laten we beginnen.Om de zuiveringsprocedure van de eyelets te starten, plaatst u de COBE-zak, klemt u alle slangen behalve de groene en stelt u in de zuurkast de snelheid in op 1500 en de super out op nul. Stel de pomp en de gradiëntbekers in en verbind de opvangslangen met de groene slang. Nu kan het laden van de FI-call beginnen; druk op spin.Voeg vervolgens 110 milliliters fi toe. Roep dit op naar het voorste bekerglas en start de pomp om de COBE-zak te vullen. Terwijl de FI wordt opgeroepe

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer de zuivering en cultuur van menselijke eilandjes van Langerhans via een gemodificeerde geautomatiseerde methode. Dit protocol zorgt voor hoogwaardige eilandjes voor klinische transplantatie.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Meer video's verkennen