Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

Hallo, mijn naam is Alexander Shiku Van Hagen. Ik ben lid van het Laboratorium voor twee Immunologie en Transportimmunologie aan het Universiteitsziekenhuis van Keulen. In deze video gaan we laten zien hoe we menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen kunnen genereren uit mononucleaire cellen uit perifeer bloed.

Een van de belangrijkste interesses van ons laboratorium is de studie naar de antilichaam-onafhankelijke functies van B-cellen. Naast hun rol als producenten van antilichamen vervullen B-cellen een belangrijke rol als antigeenpresenterende cellen, zowel onder fysiologische omstandigheden als bij auto-immuunziekten. Na activatie kunnen B-cellen krachtige antigeenpresenterende en immunostimulerende capaciteiten verwerven, vooral wanneer ze worden geactiveerd via CD 40.

CD 40. Geactiveerde B-cellen bieden verschillende voordelen in vergelijking met dendritische cellen. Ze kunnen eenvoudig en tegen relatief lage kosten worden uitgebreid uit kleine hoeveelheden perifeer bloed, zelfs bij kankerpatiënten.

Nu zullen onze PhD-student, Tanya Leic en onze technicus LER, u een stapsgewijze introductie geven over hoe u menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen uit perifeer bloed kunt genereren. Hallo, mijn naam is Tanya Livi. Ik ben een PhD-student en ik wil u demonstreren hoe u menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen kunt genereren.

Deze procedure is in ons laboratorium geoptimaliseerd. De belangrijkste stappen zijn 首先 de voorbereiding van de feeder-cellen. Hiervoor gebruiken we menselijke CD 40-ligand getransfecteerde N IH 33-cellen, die bestraald worden met 78 gray en uitgeplaat op zes-wells platen.

Ten tweede starten we de kweek van menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen vanuit gezuiverde PBMC, die worden behandeld met menselijk interleukine 4 en cyclosporine A; deze cellen worden vervolgens geplaatst op feta-cellen in zeswells platen. Deze procedure wordt herhaald op dag 7 en daarna elke drie tot vier dagen tot dag 14 van de celkweek. Om zeer zuivere menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen te verkrijgen, starten we de generatie van CD 40-geactiveerde B-cellen met vers gezuiverde of op passende wijze ontdooide menselijke PBMC.

Ten eerste wassen we de pbmc tweemaal door de cellen opnieuw te suspenderen in 50 milliliter PBS. Centrifugeer de PBMC zeven minuten bij 1300 RPM, wat overeenkomt met 260 5G. Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 50 milliliter PBS; centrifugeer ze opnieuw zeven minuten bij 1100 RPM, wat overeenkomt met 190 G. Verwijder opnieuw het supernatant voor de bepaling van het aantal cellen.

Suspendeer de PBMC in 20 milliliter PBS, meng de cellen grondig door te vortexen en bepaal het celgetal. Centrifugeer de benodigde hoeveelheid PBMC voor de CD40 B-cultuur gedurende vijf minuten bij 1200 RPM, overeenkomend met 220 5G. Voor een six-well plate zijn 4 × 10⁶ cellen per well nodig, wat neerkomt op 24 × 10⁶ cellen per plate.

Resuspendeer vervolgens de PBMC in CD 40 B-kweekmedium op een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Vul de celsuspensie aan met verse humane IL-4 in een concentratie van 50 units per milliliter voor stimulatie en cyclosporine A in een concentratie van 0,63 µg per milliliter om de uitgroei van T-cellen te remmen. De PBMC-suspensie is nu klaar voor stimulatie met CD 40-ligand.

Voor zover wij weten is er momenteel geen functioneel CD 40-ligand van GMP-kwaliteit beschikbaar. Daarom gebruiken wij met humaan CD 40-ligand getransfecteerde NIH 3T3-cellen om celoverleving, differentiatie en proliferatie te stimuleren, aangezien de NIH 3T3-cellijn gedurende enkele maanden in kweek kan overleven. Verlies van CD 40-ligandexpressie moet regelmatig via controles worden uitgesloten.

CD 40 ligand getransfecteerde NIH 3T3 is een adherente cellijn en wordt gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 in selectiemedium, dat is aangevuld met G 418 in een concentratie van 0,7 mg/mL. Deze adherente fibroblastcellijn mag nooit volledig confluent worden en moet twee keer per week gesplitst worden. Om de adherente cellen te splitsen, wordt het medium geaspireerd en wordt er eenmaal gewassen met 10 mL PBS door voorzichtig te zwenken. Aspireer het medium opnieuw en voeg 4 mL trypsine-EDTA toe in een fles van 75 cm².

Incubeer de kolf gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C in de incubator. Haal de kolf vervolgens weer uit de incubator. Tik voorzichtig tegen de kolf om de cellen van het plastic los te maken.

Voeg vervolgens 10 milliliter wild-type medium toe, draai voorzichtig heen en weer en breng de cellen over naar een 50 milliliter buis. Centrifugeer de NA eight three T three cellen vijf minuten bij 1200 RPM, wat overeenkomt met hundred and 20 5G. Resuspendeer de pelletcellen voorzichtig in 10 millimeter wild-type medium.

Bepaal het celgetal voor N IH 33 subcultuur en resuspendeer 1,5 × 10⁶ feeder-cellen in 10 milliliter wildtype medium. Transfer deze naar een fles van 75 cm² en voeg G 4 1 8 toe in een concentratie van 0,7 mg/mL om te selecteren op de getransfecteerde cellen die neomycine-resistentiegenen dragen. Incubeer de feeder-cellen tot slot bij 37 °C in 5% CO₂ voor CD 40 B-stimulatie.

Neem de resterende NI 8 3 3 cellen en bestraal deze letaal met 78 Gy om proliferatie te stoppen. Verdun de bestraalde feeder-cellen in wire type medium tot een celdichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter en plaat twee milliliter per well op een six-wellplaat. Laat de cellen op de six-wellplaten opnieuw adhereren voordat ze als feeder-cellen worden gebruikt door ze 24 uur lang te incuberen bij 37 °C en 5% CO2 voor stimulatie van B-lymfocyten met CD 40 ligand.

Controleer onder de microscoop of de feeder-cellen die een dag eerder zijn geplaatst, adherent zijn. Als de feeder-cellen adherent zijn, verwijder dan het SUP natin uit elke put en was deze snel twee keer. Was elke put eerst met twee milliliter PBS en daarna nogmaals met twee milliliter.

CD 40 B wasmedium voor stimulatie van de PBMC-suspensie. Kort van tevoren bereid met een celdichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter voor de feeder-cellen. Hiervoor wordt voorzichtig 4 mL van de celsuspensie naar elk overgebracht.

Incubeer de plaat op dag zeven bij 37 °C in 5% CO2. CD 40 B-cellen kunnen voor de eerste subcultuur van CD 40 geactiveerde B-cellen op dag zeven worden gesubcultiveerd, gevolgd door verdere subculturen elke drie tot vier dagen.

Oogst de geclusterde cellen voorzichtig uit de zes 12-wells plaat door middel van resuspensie met een 10 milliliter pipet. Breng de CD 40 B-cellen over in een 50 milliliter buis. Centrifugeer de CD 40 B-cellen gedurende zeven minuten bij 1200 RPM, overeenkomend met 220 5G volledig.

Vervang het medium door CD 40 B-wasmedium en bepaal het celgetal van de CD 40-geactiveerde B-cellen. Resuspendeer de CD 40 B-cellen op 1 × 10⁶ cellen per milliliter in CD 40 B-kweekmedium.

Voeg vervolgens vers menselijk IL-4 in een concentratie van 50 units per milliliter en cyclosporine A in een concentratie van 0,63 µg per milliliter toe aan de celsuspensie voor stimulatie. Gebruik hiervoor bestraalde feeder-cellen die één dag eerder zijn voorbereid. De bestraalde feeder-cellen moeten uiteraard direct voor gebruik opnieuw onder de microscoop op adhesie worden gecontroleerd.

Indien adherent, was de feeder-cellen snel twee keer zoals voorheen, één keer met PBS en de tweede keer met CD 40 B-wasmedium, en breng vervolgens voorzichtig vier milliliter van de CD 40 B-suspensie, aangepast naar 1×10⁶ cellen per milliliter, aan in elke put van de zes-putsplaat. De subcultuur wordt op identieke wijze herhaald na drie tot vier dagen, tweemaal per week, om op dag 14 van de cultuur te eindigen met celclusters van zeer zuivere menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen.

Op dit moment brengen CD 40 B-cellen co-stimulerende moleculen tot expressie, zoals CD 80, CD 86, CD 83 MHC-moleculen en de zogenaamde lymfeknoophoming-triade van CD 62 ligand, CCR7 en LFA-1, wat via flowcytometrie tijdens de generatie gecontroleerd kan worden. Raadpleeg voor probleemoplossing de tekstversie van dit protocol. We hopen dat CD 40-geactiveerde B-cellen in de toekomst als een belangrijk instrument voor kankerimmunotherapie zullen dienen.

Veel succes met uw experimenten.