Met behulp van de Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

Hallo, ik ben Chris Paglia, directeur van het Visual Information Processing Lab hier bij de afdeling Biomedical Engineering aan de Boston University. Hallo, ik ben Jacque Liu, promovendus in het lab van Dr. Paglia. De onderzoeksactiviteiten van ons lab zijn gericht op het begrijpen van de neurale berekeningen die dieren in staat stellen om te zien.

Voor dit onderzoek maken we gebruik van een van de oudste wezens op aarde, de Amerikaanse hoefkrab. Hoewel deze dieren als levende fossielen worden beschouwd, blijven ze een onmisbare rol spelen in het biomedisch onderzoek.

Niet alleen bevat hun bloed speciale cellen die wetenschappers gebruiken om bacteriële toxinen in onze medicijnen te detecteren, maar hun ogen bevatten ook een neuraal netwerk dat veel inzicht heeft verschaft in de werking van ons visuele systeem. De cellulaire basis van processen zoals lichtadaptatie en laterale inhibitie werd voor het eerst onthuld in studies naar de samengestelde zijenoog van het dier, en voor dit baanbrekende werk ontving Dr. Keffer Hartline in 1967 een Nobelprijs. De pijlschildpad blijft een aantrekkelijk model voor visieonderzoek omdat het dier groot en robuust is voor een ongewervelde, en zijn retina-neuronen groot en gemakkelijk toegankelijk zijn.

Het visuele systeem is compact en uitgebreid bestudeerd, en het visuele gedrag is goed gedefinieerd. Bovendien worden de structuur en functie van de ogen dagelijks gemoduleerd door een circadiane klok in de hersenen van het dier. Kortom, het visuele systeem van hoefkrabben is eenvoudig genoeg om te begrijpen, maar complex genoeg om interessant te zijn.

In deze video illustreren we drie experimentele paradigma's voor het onderzoeken van de neurologische basis van het gezichtsvermogen die in vivo kunnen worden uitgevoerd met dit klassieke diermodel. Voor visueel onderzoek zijn dit het registreren van het elektroretinogram, het registreren van de oogzenuw en intraretinale registratie. De hoefkrabben worden gehouden in een beluchte zoutwatertank in een ruimte die is blootgesteld aan een gereguleerde licht-donkercyclus.

Voordat men begint met een van deze registratietechnieken, worden de dieren ongeveer 10 minuten gekoeld in een ijsemmer en vervolgens vastgezet op een houten platform door twee roestvrijstalen schroeven in het prosoma en twee in het opisthosoma te plaatsen. Het platform is aan de onderzijde verzwaard met graniet zodat het in het water zinkt. Het elektroretinogram of ERG wordt gebruikt om de ooggevoeligheid in de loop van de tijd te bewaken.

Het meet de totale elektrische respons van alle cellen in het oog. Voor de lichtflits-methode zijn de volgende instrumenten nodig voor deze procedure: een schroevendraaier, vaseline, ringersoplossing, een pipet, een LED, een registratiekamer, roestvrijstalen schroeven en een wattenstaafje. We gebruiken een zelfgebouwde registratiekamer om het ERG te meten.

De behuizing is ontworpen om een reservoir met zoutoplossing in contact met het oog te houden. Het deksel bevat een zilverchloride-draad voor de koppeling van de geleidende oplossing aan een versterker en een klein gat met een afmeting die geschikt is voor een LED vóór de bevestiging. De onderzijde van de kamer is bekleed met vaseline.

De kamers worden vervolgens met twee schroeven over het oog van de hoefkrab vastgezet, gevuld met zoutoplossing en afgesloten. Het dier wordt in een lichtdichte kooi in een tank geplaatst, gevuld met zeewater tot boven de kieuwen. De LED-kabel wordt in het deksel van de kamer gestoken.

De signaalleiding wordt vastgezet aan de kamerdraad en de referentieleiding aan een van de geïmplanteerde schroeven, waarna beide leidingen worden aangesloten op de headstage van een differentiaalversterker met hoge impedantie voor signaalversterking en ruisfiltering. De kooi wordt vervolgens gesloten om te voorkomen dat kamerlicht het dier bereikt. De ad-stage wordt aangesloten op de versterker en de filters van de versterker worden ingesteld om frequenties onder ongeveer 10 hertz door te laten.

Vanaf daar gaat het signaal naar een oscilloscoop voor visualisatie en naar een data-acquisitiekaart voor computeranalyse en opslag; we gebruiken een op maat gemaakt programma geschreven in LabVIEW om lichtstimuli via de LED toe te dienen en het ERG-signaal te registreren. De LED wordt elke 10 minuten geactiveerd met een puls van 100 milliseconden van 5 V. Links wordt de ERG-golfvorm van elke lichtflits weergegeven, en rechts is de piek-tot-piekamplitude van opeenvolgende flitsgolfvormen uitgezet om veranderingen in de ooggevoeligheid in de loop van de tijd te volgen.

Met ERG-registraties kan men de effecten van lichtadaptatie en circadiane neurale modulatie bestuderen. Het oog geleidt visuele signalen naar de hersenen via de spike-responsen van de vezels van de oogzenuw. De gecodeerde signalen kunnen worden bestudeerd door extracellulair te registreren vanuit individuele zenuwvezels.

Circadiane kloksignalen die teruggekoppeld worden naar het oog kunnen ook met deze methode worden bestudeerd. De benodigdheden voor deze procedure omvatten een schroevendraaier, een ringoplossing, scharen, een registratiekamer, gebogen pincetten, een fijne naaldsonde, een stomp scalpel, chirurgische scharen en een sectie-elektrode. De registratiekamers zijn ontworpen met een lip om de zenuw te accommoderen; 20 milliliters bloed kan uit het paard worden gedraineerd door een naald van 16 gauge tussen de scharnierspieren en naar het hart in te brengen.

Exsanguinatie is niet noodzakelijk, maar maakt de dissectie van de oogzenuw eenvoudiger wanneer het dier aan het platform is bevestigd. De locatie van de oogzenuw wordt geschat door een licht gebogen lijn op het carpus te trekken tussen de laterale en mediale ogen. Vervolgens wordt met een refin een cirkelvormig gat in het carpus gemaakt.

Het gat heeft dezelfde diameter als de bodem van de kamer. Het middelpunt van het gat bevindt zich ongeveer twee centimeter anterieur van het laterale oog en iets dorsaal van de lijn, zodat de zenuw langs het ventrale gedeelte van de kamer loopt; het bovenliggende bindweefsel wordt verwijderd totdat de volledige lengte van de zenuw zichtbaar is en de blootgelegde zenuw wordt bevrijd van het omliggende en onderliggende weefsel. Een draad wordt om de zenuw geslagen en door de halfronde opening in de bodem de kamer in getrokken.

Via dezelfde opening wordt de zenuw voorzichtig in de kamer geleid door aan het draadje te trekken. Terwijl de zenuw de kamer binnentreedt, wordt de bodem in het gat geduwd om de rek op de zenuw te minimaliseren. De kamer wordt vervolgens met twee schroeven bevestigd en gevuld met Ringer-oplossing.

Na bevestiging van de kamer wordt het dier in een kooi met een lichte getijdenstroom geplaatst in een tank gevuld met zeewater tot over de kieuwen. De binnenzijde van de kamer wordt gevisualiseerd onder een stereoscoop en rond de opening van de bodem wordt watten aangebracht om lekkage van bloed in de kamer en van Ringer-oplossing uit de kamer te voorkomen. De kamer wordt opnieuw gevuld met verse Ringer-oplossing.

Residuen van weefsel worden verwijderd met fijne scharen en pincetten. Er wordt een kleine incisie gemaakt in de schede die de zenuw omhult, waarna de zenuw met een fijne naaldsonde van de schede wordt gescheiden. De schede wordt geleidelijk afgewikkeld en verwijderd door langs de lengte van de zenuw te knippen.

Vervolgens wordt een klein vezelbundeltje met de probe van de zenuw gescheiden en wordt deze aan het uiteinde dat het verst van het oog afligt doorgesneden voor de registratie van afferente vezels, en aan het uiteinde dat het dichtst bij het oog ligt voor de registratie van efferente vezels. Voor de registratie gebruiken we een AM-systeem sectie-elektrode gevuld met Springer-oplossing, die via slangetjes is verbonden met een Gilman-spuit voor zuiging. De elektrodepunt wordt gemaakt door het uiteinde van een borosilicaatglazen capillair met een diameter van 1 mm vuur te polijsten. Een B- en C-verbinding zorgt voor de signaalleiding, en de referentieleiding is een zilverchloride-draad die om de elektrode is gewikkeld om ruis te verminderen.

De elektrodepunt wordt in de registratiekamer geplaatst en het afgesneden uiteinde van het zenuwbundel wordt via zuiging in de glazen punt getrokken. De signaal- en referentieleidingen worden aangesloten op de head stage van een differentiële versterker voor signaalversterking en ruisfiltering. De uitgang van de versterker wordt doorgegeven aan een oscilloscoop voor visualisatie en aan een data-acquisitiekaart voor computeranalyse en opslag.

We gebruiken een op maat gemaakt programma geschreven in LabVIEW om lichtstimuli aan te sturen en een digitale spike-discriminator om spike-treinen te registreren. Voor de belichting van individuele cellen wordt een glasvezel lichtgeleider gebruikt, terwijl voor patroonstimulatie met registraties van de oogzenuw een computergestuurd videoscherm wordt ingezet; hiermee kan de signaaloverdracht tussen de ogen en de hersenen intraretinaal worden bestudeerd. De registratie omvat het direct inbrengen van een micro-elektrode in cellen in het oog en het registreren van de door licht geïnduceerde intracellulaire spanningsschommelingen.

De benodigde hulpmiddelen voor deze procedure zijn een schroevendraaier, een L-vormig transparant platform. De geschroefde schroefgaten een micro-elektrode over de glaselektrode, roestvrijstalen schroeven, een pincet en een fijn scalpel. Na het fixeren van de krab, een stevige boom, een houten platform, wordt een transparante plaat met vooraf ingestelde schroefgaten aan de carpus bevestigd met twee schroeven aan de zijkant en één aan de bovenkant.

Het dier wordt in een lichtdichte kooi geplaatst in een tank gevuld met zeewater boven de kieuwen. Een gemotoriseerde micro-positioneerder wordt met schroeven aan de plaat bevestigd en de arm van de positioneerder wordt boven het oog uitgelijnd. Een reeks glazen micropipetten wordt getrokken uit silicaatglas met een buitendiameter van 1 mm, en de punten worden door capillaire werking gevuld.

Door de pipetten enkele minuten in een vial met een drie molaire kaliumchloride-oplossing te plaatsen, wordt de rest van de pipet handmatig gevuld met de zoutoplossing en vervolgens ingebracht in een micro-elektrodehouder die vooraf met oplossing is gevuld om belvorming te voorkomen. De elektrodehouder wordt vervolgens in de head stage van een intracellulaire versterker geplaatst die aan de micro-positioneerder is bevestigd. Een deel van het netvlies wordt blootgelegd door voorzichtig een klein vierkant gedeelte van het dorsale hoornvlies weg te snijden.

Met het scalpel wordt een druppel Ringer-oplossing op het blootgestelde weefsel aangebracht om uitdroging te voorkomen, waarna de micropipet richting het netvlies wordt bewogen. Zodra de punt van de pipet de oplossing raakt, wordt de huidige injectiemodus van de intracellulaire versterker geactiveerd en wordt de impedantie van de elektrode gemeten; micropipetten met impedanties buiten het bereik van 20 tot 70 mega ohm worden weggegooid. De pipetten die binnen dit bereik vallen, worden in stappen van micrometers grootte in het netvlies bewogen en in cellen gepenetreerd door de punt elektronisch te laten vibreren; lichtstimuli worden toegediend via een glasvezelbuis of videoscherm om cellen te penetreren.

In het oog van de hoefkrab kunnen drie typen cellen worden aangetroffen: ularcellen, excentrische cellen en pigmentcellen. Ularcellen vertonen een grote depolariserende respons op licht, excentrische cellen vertonen een reeks actiepotentialen op een depolariserende respons, en pigmentcellen vertonen helemaal geen respons op licht. De respons wordt waargenomen op een oscilloscoop en vastgelegd op een computer met intraretinale registraties. Hiermee kan de cellulaire basis van het gezichtsvermogen worden bestudeerd.

Tot slot hebben we aangetoond hoe elektroretinogram-registraties, oogzenuwregistraties en intraretinale registraties in vivo bij hoefkrabben kunnen worden uitgevoerd. Deze methoden worden op grote schaal gebruikt en bieden unieke inzichten in de neurale mechanismen van de verwerking van visuele informatie bij hoefkrabben. Ze zijn niet alleen eenvoudig toe te passen in een onderzoekslaboratorium, maar kunnen ook gemakkelijk worden geïntegreerd in een onderwijslaboratorium voor visuele neurofysiologie.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.