Name: Grote Plaats Milieu Genomic Library Production (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Leer hoe je een fosmidbibliotheek bouwt uit milieu-DNA van een seizoensgebonden hypoxische fjord. Deze methode archiveert klonen in 384-well platen voor toekomstige sequencing en functionele screening van microbiële gemeenschappen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio&#39;s van kust-en open water van de oceaan. MT en SL werden ondersteund door beurzen uit het TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie (CMDE). MT kreeg ook fellowship steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Een procedure wordt beschreven hoe u de meest efficiënte wijze een grote insert fosmid bibliotheek met genomisch DNA afgeleid uit een kust watermonster te genereren. Up-stream genomisch DNA-extractie wordt beschreven in een apart protocol [3]. Omdat de fosmid-bibliotheek is een productie van meerstaps-proces, plan minstens twee tot drie weken op tijd voor de hele procedure, inclusief alle vier gepresenteerde stappen. De winning van genomisch DNA is de meest cruciale stappen en alle down-stre...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Stap II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid Library Production Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>voldoende om 9-10 fosmid-bibliotheken te genereren</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>roerplaat</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1.0X TAE loopbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEF Mapper XA gepulst veldelektroforese-systeem inclusief koelmodule en variabele snelheidspomp</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10,000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>magnetronbestendige plastic folie</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase Agarose Gel-Digesting Preparation</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 centrifugale filtereenheid met Ultracel-10 membraan</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 centrifugale filtereenheid </td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>nucleasevrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>digitale dry block heater</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>waterbad</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>centrifugerotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>tafelcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugebuisjes, 1.7 mL, transparant</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuisjes </td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stap III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>faagverdunningsbuffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>cryovials</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Stap IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plaat met deksel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>384-well plaat met deksel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100 O.D. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 150 Dia. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB-bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>glazen kraaltjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix colony picker</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>plukkop (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

grote plaats milieu genomic library production

Large Insert Environmental Genomic Library Production

De overgrote meerderheid van micro-organismen in de natuur op dit moment ontoegankelijk blijven voor de traditionele teeltmethoden. In het afgelopen decennium, de cultuur-onafhankelijke milieu-genoom (<em&gt; Dat wil zeggen</em&gt; Metagenomic) benaderingen naar voren zijn gekomen, zodat onderzoekers deze teelt kloof te overbruggen door het vastleggen van de genetische inhoud van de inheemse microbiële gemeenschappen direct uit de omgeving. Daartoe zijn genomische DNA-bibliotheken gebouwd met behulp van standaard-zij het kunstzinnige laboratorium kloontechnieken. Hier beschrijven we de bouw van een grote insert milieu genomische fosmid bibliotheek met DNA afgeleid van de verticale diepte continuüm van een seizoen hypoxische fjord. Dit protocol is direct gekoppeld aan een reeks van samenhangende protocollen waaronder kustgebieden zeewater bemonstering [1], grote hoeveelheden filtratie van microbiële biomassa [2] en een DNA-extractie en zuivering van het protocol [3]. In het begin, hoge kwaliteit genomisch DNA is end-gerepareerd met de creatie van 5-gefosforyleerd stompe uiteinden. End-DNA gerepareerd wordt onderworpen aan pulsed-field gel elektroforese (PFGE) voor grootte selectie en gel extractie wordt uitgevoerd om DNA-fragmenten te herstellen tussen de 30 en 60 duizend basenparen (Kb) in de lengte. Geselecteerde formaat DNA wordt gezuiverd uit de buurt van de PFGE gel matrix en geligeerd aan de fosfatase behandelde blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRUM<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Lineaire concatemers van pCC1 en steek DNA worden vervolgens headfull verpakt in faag deeltjes door lambda terminase, met de daaropvolgende infectie van faag-resistente<em&gt; E. coli</em&gt; Cellen. Succes getransduceerde klonen worden teruggewonnen op LB agar platen onder antibiotische selectie en gearchiveerd in 384-wells plaat formaat met behulp van een geautomatiseerd kolonie picking robot (Qpix2, GENETIX). Het huidige protocol put uit diverse bronnen, waaronder de CopyControl Fosmid Library Production Kit uit EPICENTRUM en de gepubliceerde werken van meerdere onderzoeksgroepen [4-7]. Elke stap wordt gepresenteerd met de beste praktijk in het achterhoofd. Waar mogelijk hebben we subtiliteiten in de uitvoering benadrukken om de algehele kwaliteit en efficiëntie van de bibliotheek te verbeteren. Het hele proces van fosmid bibliotheek productie en geautomatiseerde kolonie plukken duurt minstens 7-10 dagen, omdat er veel inbegrepen incubatie stappen. Echter, er zijn verschillende stopplaatsen mogelijk die worden vermeld in het protocol.

Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

De overgrote meerderheid van de microben in de natuur blijft momenteel ontoegankelijk voor traditionele kweekmethoden. In het afgelopen decennium zijn cultuuronafhankelijke...

Hallo, ik ben Marcus uit het laboratorium van Steven Helm van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de constructie van een omgevingsbibliotheek met grote inserten. San Lee helpt mij vandaag bij de procedure en zal de faagverpakking en infectie van de bibliotheekgast e coli uitvoeren, samen met Elise Hawley en Chin Yang, die het plukken van kolonies zullen verzorgen.We hanteren deze procedure in ons laboratorium om de structuur en het metabolisme van microbiële gemeenschappen in mariene en terrestrische omgevingen te bestuderen. Laten we beginnen. Dit protocol voor het aanmaken van een fosmide-DNA-bibliotheek start na de isolatie en het shearren van genomisch DNA uit biomassestalen, procedures die we in detail hebben beschreven in begeleidende JoVE-artikelen.De volgende stappen bereiden het SHE-DNA voor op ligatie in de SMID-vector PCC one. De eerste stap is het herstellen van de uiteinden van de SHE-DNA-fragmenten en het fosforyleren van de 5'-uiteinden. Alle reagentia die nodig zijn voor deze stap zijn inbegrepen in de PCC one SMID library production kit van epicenter. Om de end-repair-reactie voo

large-insert-environmental-genomic-library-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

De genetische reportertest is een goed gevestigd en krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de relatie tussen DNA-sequenties en hun gen-regulerende activiteiten. Het koppelen van kandidaat-regulerende elementen aan reportergenen die identificerende sequentietags dragen, maakt massale parallelisatie van deze tests mogelijk.

Massively Parallel Reporter Testen in gekweekte zoogdiercellen

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Dit protocol beschrijft een alomvattende aanpak voor het kweken, sequentiëren en de novo hybride genoomassemblage van urinebacteriën. Het biedt een reproduceerbare procedure voor het genereren van volledige, circulaire genoomsequenties die nuttig zijn bij het bestuderen van zowel chromosomale als extrachromosomale genetische elementen die bijdragen aan urinaire kolonisatie, pathogenese en verspreiding van antimicrobiële resistentie.

Hybride de novo genoomassemblage voor het genereren van complete genomen van urinebacteriën met behulp van short- en long-read sequencing-technologieën

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer hoe je een fosmidbibliotheek bouwt uit milieu-DNA van een seizoensgebonden hypoxische fjord. Deze methode archiveert klonen in 384-well platen voor toekomstige sequencing en functionele screening van microbiële gemeenschappen.

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

Meer video's verkennen