Grote Plaats Milieu Genomic Library Production
23 september 2009
Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.
Hi, ik ben Marcus uit het laboratorium van Steven Helm in het Department of Microbiology and Immunology aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de constructie van een grote insert omgevingsbibliotheek. Ik word geassisteerd door San Lee, die zal zorgen voor faagverpakking en infectie van de bibliotheek gastheer E. coli, evenals Elise Hawley en Chin Yang die de kolonie picking zullen uitvoeren.
We hebben deze procedure in ons laboratorium om microbio-gemeenschapsstructuur en metabolisme in mariene en terrestrische omgevingen te bestuderen. Laten we dus beginnen. Dit protocol voor het maken van een fo smid DNA-bibliotheek begint na isolatie en scheuren van genomisch DNA uit biomassamonsters. Procedures die we hebben gedetailleerd in bijbehorende Jo of artikelen.
De volgende stappen bereiden de SHE DNA voor ligatie in de SMID vector PCC een. De eerste stap is om de uiteinden van de SHE DNA-stukken te repareren en te fosforyleren. De vijf prime uiteinden, alle reagentia die nodig zijn voor deze stap zijn opgenomen in het PCC een SMID bibliotheek productiekit van epicenter om de end repair reactie op te zetten, ontdooi alle reagentia op ijs, combineer vervolgens de end repair buffer DNTP, mix een TP tot 20 microgram van she insert DNA bij 0,5 microgram per microliter enzymmix en water Tot 80 microliters. Centrifugeer de buis kort om alle vloeistof naar de bodem te brengen.
Incubeer de end repair reactie op kamertemperatuur gedurende 45 minuten tot een uur. Verhit vervolgens, deactiveer de enzymen bij 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Tijdens de end repair incubatie kunt u de gel voorbereiden voor de volgende stap.
Pulsed field gelelektroforese of PFGE, uw doel is om DNA-moleculen te isoleren die variëren van 30 tot 60. Kilobasen PFGE is een elektroforesemethode voor het oplossen van deze grote fragmenten die tijdens standaard elektroforese samenlopen. Om te beginnen, bereid een 1% gel voor met lage smeltende aros in 150 milliliters van een XTAE loopbuffer.
Kies kammen die u toelaten om de volledige 80 microliter sample van end repair DNA plus laadbuffer in een of twee putjes te laden. Wees vooral voorzichtig bij het hanteren van de gel, aangezien lage smeltende aros gels. Breken heel gemakkelijk terwijl de gel aan het stollen is.
Bereid de elektroforesekamer voor. Voeg 2,2 liter van een XTAE toe aan de kamer en zet het apparaat aan om de loopbuffer te laten circuleren. Stel het koelapparaat in op 14 graden Celsius en stel de pomp in op 70 RPM.
Voeg een middenklasse een PFG marker toe, ook van NEB. Om te voorkomen dat u uw gel te hoog snijdt, extrudeer aros uit de gel spuit en snijd een kleine plug van het uiteinde met het scalpel. Plaats de plug aan de voorkant van de put en verzegel met gesmolten aros.
Zorg ervoor dat de loopbuffer is afgekoeld tot 14 graden Celsius voordat u uw gel laadt. Laad in de eerste put vijf microliters van New England Biolabs Lambda Hindi drie digest. Laad in de tweede put een microliter van de Smid control grootte marker verdund in 10 microliters steriele water plus laadbuffer.
Laad vervolgens uw end gerepareerde en hitte-geïnactiveerde mix plus laadbuffer. Sluit het deksel en programmeer de machine. De gel zal overnacht of 12 uur draaien.
Wanneer de gel klaar is met lopen, gebruik een cyber goud kleurstof om de DNA te visualiseren. Verdun de cyber goud in 250 milliliters van een XTAE, plaats uw gel in de oplossing en kleur gedurende een uur in het donker. Cyber goud is lichtgevoelig. Terwijl de gel kleurt, bereid een waterbad voor op 70 graden Celsius en een F 45 graden Celsius voor de gelextractiestap die volgt.
De volgende stap is om uit te snijden en gel. Zuiver het DNA binnen uw gewenste groottebereik van 30 tot 60 kilobasen. Neem uw gekleurde gel samen met een lege gescheurde en gelabelde micro subterfuge buis en een steriele scalpel naar de blauwe licht transluminator.
Bekleed de transluminator met plasticfolie om kruisbesmetting van uw gel te voorkomen. Draag de kijkbrillen en zet het blauwe licht aan. Nu kunt u uw end gerepareerde genomische DNA en de FO smid control grootte marker zien. Snijd met de scalpel een gelslice van vijf tot zeven millimeter breed dat is gemigreerd met en iets boven de smid control grootte marker.
Gebruik de PFG marker als een bovengrens voor uw slice. Breng de slice over naar de gescheurde buis. U kunt de slices tot een jaar lang bij minuus 20 graden Celsius bewaren voordat u verder gaat.
Nu is het tijd om gel. Zuiver het DNA uit uw slice. Weeg de buis met uw gelslice en bereken het gewicht van de slice door het gewicht van de scheur af te trekken.
Smelt vervolgens de slice in het 70 graden Celsius waterbad gedurende 10 tot 15 minuten. Nadat uw gelslice volledig is gesmolten, breng de buis snel over naar het 45 graden Celsius waterbad. Houd in gedachten dat één milligram vaste gel na het smelten een volume van één microliter heeft.
Voeg één eenheid of één microliter Jase enzympreparaat toe per 100 microliters gesmolten aros. Incubeer bij 45 graden Celsius gedurende één uur. Voeg vervolgens twee tot vier microliters meer les toe en incubeer gedurende nog eens één uur bij 45 graden Celsius.
Deactiveer de gel gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius na verhitting. Deactiveer het enzym, plaats de buis gedurende 10 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens met maximale snelheid. 13.000 RPM gedurende 15 minuten om eventuele onoplosbare deeltjes te pelletten.
Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Verwijder het bovenste supernatant dat uw gezuiverde DNA bevat en breng het over naar een 15 milliliter falcon buis. Was vervolgens met drie milliliters steriele water om de DNA te wassen en concentreren.
Breng de oplossing over van de 15 milliliter Falcon buis naar een Ancon Ultra vier centrifugale filtereenheid met een ultra cel 10 membraan. Plaats de filtereenheid in een slingerbeker rotor met behulp van een 50 milliliter falcon buis als adapter en centrifugeer gedurende zes tot acht minuten bij 4.000 GS. Centrifugeer tot ongeveer 100 tot 500 microliters op
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de constructie van een fosmid-bibliotheek met behulp van omgevingsgenoom-DNA uit een seizoensgebonden hypoxische fjord. De bibliotheek is gearchiveerd in 384-well platen voor toekomstige sequencing en functionele screening.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Omgevingsgenomica
- Zeebiologie
Achtergrond
- Isolatie en schaafsel van genoom-DNA uit biomassamonsters.
- Studie van microbiële gemeenschapsstructuur en metabolisme.
- Toepassing van geautomatiseerde systemen voor kolonie-picking.
- Focus op omgevingen met variërende zuurstofniveaus.
Doel van de studie
- Om een omgevingsbibliotheek met grote inserts te creëren.
- Om downstream sequencing en functionele analyse te vergemakkelijken.
- Om het begrip van microbiële diversiteit in specifieke omgevingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van genoom-DNA uit omgevingsmonsters.
- Schaafsel van DNA om geschikte fragmenten voor klonen te creëren.
- Faag-packaging en infectie van E. coli-gastheer.
- Geautomatiseerde kolonie-picking voor bibliotheekconstructie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van een fosmid-bibliotheek.
- Archivage van klonen in 384-well platen.
- Voorbereiding voor sequencing en functionele screening.
- Oprichting van een bron voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen.
Conclusies
- De methode maakt efficiënte bibliotheekconstructie mogelijk van omgevingsmonsters.
- Vermakkelijket toekomstig onderzoek naar microbiële diversiteit en functie.
- Dragen bij aan het begrip van ecosystemen die door hypoxie worden beïnvloed.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Large insert environmental genomic library production enables direct access to uncultivable microbial genetic diversity, supporting early-stage target discovery and functional screening in biopharma R&D. This approach expands the repertoire of novel genes and pathways available for therapeutic and biotechnological innovation, reducing reliance on traditional cultivation and increasing predictive confidence in environmental gene mining. Integration of automated archiving and high-throughput workflows positions these libraries as reusable assets for portfolio-wide discovery initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental gene pools for novel target identification.
- Facilitates functional validation of genes and pathways inaccessible by cultivation.
- Supports mechanistic de-risking by capturing native genetic context.
- Provides a foundation for predictive confidence in target selection from complex microbiomes.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, size-selected DNA libraries for downstream functional assays.
- Standardizes library construction and archiving for reproducible screening campaigns.
- Enables scalable, automated colony picking and high-throughput screening readiness.
- Supports reliable evaluation of gene function and compound interactions in environmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns environmental gene discovery with translational biomarker exploration when disease-relevant pathways are identified.
- Maintains continuity from environmental sampling through preclinical validation of microbial functions.
- De-risks advancement decisions by providing comprehensive genetic resources for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges environmental sampling and high-throughput screening, supporting workflows from early discovery through lead identification and functional validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway elucidation by capturing native microbial genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs via archived clone libraries and automated picking.
- Analytics: Facilitates comparative analysis of gene content and function across environmental gradients.
- Translational Research: Supports biomarker alignment when environmental genes map to disease-relevant pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a renewable resource for ongoing target mining and functional genomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates library production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient exploration of novel targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and broadens the scope of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental genomics, molecular cloning, and high-throughput automation.
- Demands access to pulsed-field gel electrophoresis, automated colony pickers, and robust archiving infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and quality control checkpoints.
- Adaptation may be needed for different environmental sources or target size ranges.
- Process duration and incubation steps require careful planning and resource allocation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:07
Introduction
0:43
End Repair of Sheared Genomic DNA
4:48
DNA-recovery by Gel Extraction and Ligation of Recovered DNA to the Fosmid Cloning Vector
20:32
Conclusion
2:10
Size-Selection of Genomic DNA by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
10:18
Phage-packaging of Vector-insert Ligation Product and Infection of Phage-Resistant Bacteria
17:46
Colony Picking, Culturing, and Long-Term Storage
14:30
Plating and Titering
16:34
Preparation for Colony Picking
