Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

Hallo, ik ben Marcus uit het laboratorium van Steven Helm van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de constructie van een omgevingsbibliotheek met grote inserten. San Lee helpt mij vandaag bij de procedure en zal de faagverpakking en infectie van de bibliotheekgast e coli uitvoeren, samen met Elise Hawley en Chin Yang, die het plukken van kolonies zullen verzorgen.

We hanteren deze procedure in ons laboratorium om de structuur en het metabolisme van microbiële gemeenschappen in mariene en terrestrische omgevingen te bestuderen. Laten we beginnen. Dit protocol voor het aanmaken van een fosmide-DNA-bibliotheek start na de isolatie en het shearren van genomisch DNA uit biomassestalen, procedures die we in detail hebben beschreven in begeleidende JoVE-artikelen.

De volgende stappen bereiden het SHE-DNA voor op ligatie in de SMID-vector PCC one. De eerste stap is het herstellen van de uiteinden van de SHE-DNA-fragmenten en het fosforyleren van de 5'-uiteinden. Alle reagentia die nodig zijn voor deze stap zijn inbegrepen in de PCC one SMID library production kit van epicenter. Om de end-repair-reactie voor te bereiden, ontdooi alle reagentia op ijs en combineer vervolgens de end-repairbuffer, dNTP's, tot 20 µg SHE-insert-DNA bij 0,5 µg per µL, enzymmix en water om een totaalvolume van 80 µL te bereiken. Centrifugeer de buis kort om alle vloeistof naar de bodem te brengen.

Incubeer de end-repair reactie gedurende 45 minuten tot een uur bij kamertemperatuur. Verhit het mengsel vervolgens om de enzymen te inactiveren bij 70 °C gedurende 10 minuten. Tijdens de incubatie van de end-repair kunt u de gel voor de volgende stap voorbereiden.

Bij gepulseerde veldelektroforese (PFGE) is het doel om DNA-moleculen te isoleren met een grootte van 30 tot 60 kb. PFGE is een elektroforetische methode om deze grote fragmenten te scheiden, die bij standaardelektroforese samen migreren. Begin met het bereiden van een 1% gel met laagsmeltende agarose in 150 milliliters van een 1X TAE-loopbuffer.

Kies kammen waarmee het volledige monster van 80 µL end-repair DNA inclusief laadbuffer in één of twee putjes kan worden geladen. Wees extra voorzichtig bij het hanteren van de gel, aangezien laagsmeltende agarosegels zeer gemakkelijk breken terwijl de gel stolt.

Bereid de elektroforesekamer voor. Voeg 2,2 liter van een XTAE-buffer toe aan de kamer en zet het apparaat aan om de loopbuffer te laten circuleren. Stel het koelapparaat in op 14 °C en zet de pomp op 70 RPM.

Voeg ook een mid-range PFG-marker van NEB toe. Om te voorkomen dat u de gel te hoog doorsnijdt, perst u aros uit de gelspuit en snijdt u met het scalpel een kleine plug van het uiteinde af. Plaats de plug aan de voorkant van het putje en verzegel deze met gesmolten aros.

Zorg ervoor dat de loopbuffer is afgekoeld tot 14 °C voordat u de gel beladt. Laad in de eerste put vijf µL van de New England Biolabs Lambda Hindi III-digest. Laad in de tweede put één µL van de Smid control-groottemarker, verdund in 10 µL steriel water plus laadbuffer.

Laad vervolgens uw mengsel na end-reparatie en hitte-inactivatie, samen met de ladingsbuffer. Sluit het deksel en programmeer het apparaat. De gel zal gedurende de nacht of 12 uur lopen.

Wanneer de gel klaar is met lopen, gebruik dan een cyber gold-kleuring om het DNA te visualiseren; verdun de cyber gold in 250 milliliter 1X TAE. Plaats de gel in de oplossing en kleur deze gedurende één uur in het donker, aangezien cyber gold lichtgevoelig is. Terwijl de gel kleurt, bereidt u een waterbad voor op 70 °C en één op 45 °C voor de daaropvolgende stap van de gelectroforese-extractie.

De volgende stap is het uitsnijden en geleren. Zuiver het DNA binnen het gewenste groottebereik van 30 tot 60 kilobases. Neem de gekleurde gel, samen met een lege, opengeknipte en gelabelde microcentrifugebuis en een steriele scalpel, naar de blauwlicht-transilluminator.

Bekleed de transilluminator met vershoudfolie om kruisbesmetting van uw gel te voorkomen. Zet de kijkbril op en schakel het blauwe licht in. Nu kunt u uw gerepareerde genomische DNA aan de uiteinden en de FO smid-controle groottemarker zien. Snijd met de scalpel een gelplakje van vijf tot zeven millimeter breed uit die is gemigreerd ter hoogte van en iets boven de smid-controle groottemarker.

Gebruik de PFG-marker als bovenste grens voor uw fractie. Breng de fractie over naar de gelabelde buis. U kunt de fracties tot één jaar bewaren bij -20 °C voordat u verdergaat.

Nu is het tijd voor het geleren. Zuiver het DNA uit uw fragment. Weeg de buis met het gelfragment en bereken het gewicht van het fragment door het lege gewicht van de buis eraf te trekken.

Smelt vervolgens de slice in het waterbad van 70 °C gedurende 10 tot 15 minuten. Zodra de gel-slice volledig is gesmolten, brengt u de buis snel over naar het waterbad van 45 °C. Houd er rekening mee dat één milligram vaste gel na het smelten een volume van één µL heeft.

Voeg één unit of één µL Jase-enzympreparaat toe per 100 µL gesmolten aros. Incubeer gedurende één uur bij 45 °C. Voeg vervolgens nog twee tot vier µL les toe en incubeer nogmaals één uur bij 45 °C.

Inactiveer de gel gedurende 10 minuten bij 70 °C na verhitting. Om het enzym te inactiveren, wordt de buis 10 minuten op ijs geplaatst en vervolgens gecentrifugeerd bij maximale snelheid (13.000 RPM) gedurende 15 minuten om onoplosbare deeltjes te pelletteren.

Zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord. Verwijder het bovenste supernatant dat het gezuiverde DNA bevat en breng dit over naar een Falcon-buis van 15 milliliter. Verdun het vervolgens met drie milliliter steriel water om het DNA te wassen en te concentreren.

Overbreng de oplossing van de 15 milliliter Falcon-buis naar een Ancon Ultra four centrifugale filtereenheid met een ultra cell 10 membraan. Plaats de filtereenheid in een swing-out rotor met een 50 milliliter Falcon-buis als adapter en centrifugeer bij 4,000 GS gedurende zes tot acht minuten. Centrifugeer tot er ongeveer 100 to 500 microliters oplossing overblijft.

Blijf op het filter en gooi het filtraat weg. Voeg vervolgens nog drie milliliter steriel water toe aan de lege falcon-buis. Breng de oplossing over naar de Amon-buis en herhaal de centrifugatiestap.

Was de falcon tube voor een derde maal en reduceer het uiteindelijke volume dat op het filter is verzameld tot 50 tot 100 µL. U hoeft zich geen zorgen te maken over het verlies van het monster. Het filter houdt 50 µL vloeistof vast, zelfs na langdurige centrifugatie.

Breng de resterende DNA-oplossing uit de AmCon-buis over naar een vooraf gewassen MicroCon YM 50 centrifugale filtereenheid en spoel de AmCon-buis met nogmaals 50 µL steriel water om al het DNA terug te winnen. Centrifugeer de MicroCon YM 50 centrifugale filtereenheid in een microcentrifuge bij 10.000 ×g totdat het filter nog net bedekt is met vloeistof. Controleer elke minuut.

Indien er slechts een kleine hoeveelheid vloeistof op het filter achterblijft, keer het filter om en win uw DNA-oplossing terug door middel van een tweede centrifugatiestap bij 1000 GS gedurende drie minuten in een nieuwe microcentrifugebuis. Het resulterende volume mag in totaal niet meer dan 10 tot 15 µL bedragen.

Anders kan uw DNA te sterk verdund zijn voor de ligatie. Controleer de concentratie van de resulterende DNA-oplossing via NanoDrop of een Pico Green-assay. Hersteld en gerepareerd.

Het DNA is nu klaar om te worden geligeerd aan de PCC one FO SMID-cloningsvector; ontdooi alle reagentia op ijs voor de ligatie. Combineer deze vervolgens in de hieronder vermelde volgorde, waarbij na elke toevoeging wordt gemengd. Voeg eerst steriel water toe om een reactievolume van 10 µL te bereiken.

Voeg vervolgens 10 x fast link ligatiebuffer toe, 10 millimolar A-T-P-P-C-C, één SMID-vector en insert in een molaire ratio van 10 op 1. Voeg tot slot fast link DNA-ligase toe. Centrifugeer de buis kort om alle vloeistof naar de bodem te brengen.

Tik tegen de buis en centrifugeer opnieuw. Incubeer de ligatiereactie gedurende twee uur bij kamertemperatuur en inactiveer het enzym door 10 minuten te verhitten bij 70 °C. Op dit punt kunt u de ligatiereactie bewaren bij -20 °C of doorgaan naar de stap voor faagverpakking.

De volgende stap is het genereren van bacteriofagen die zullen dienen om uw FO SMID-bibliotheek in e coli te introduceren. Twee of drie dagen voordat u de stap voor fage-packaging plant, strijkt u de meegeleverde EPI 300 T1-resistente plating-stam uit op een gewone LB-plaat en incubeert u deze gedurende de nacht bij 37 °C om enkelvoudige kolonies te verkrijgen. U kunt deze plaat afsluiten en bewaren bij 4 °C voor toekomstig gebruik. De dag voor de packaging-reacties inoculeert u 50 mL LB-bouillon plus 10 mM magnesiumsulfaat met een enkelvoudige kolonie van uw Epi 300-plaat. Schud dit gedurende de nacht bij 225 RPM en 37 °C.

Inoculeer op de dag van de verpakkingsreacties 50 milliliter vers LB-medium plus 10 millimolar magnesiumsulfaat met vijf milliliter van de overnight-cultuur. Kweek de bacteriën bij 37 graden Celsius tot een OD 600 van 0,8 tot 1,0. Overschrijd een OD 600 van 1,0 niet.

Verdun uw monster voordat u de meting met de spectrofotometer uitvoert om een nauwkeurig resultaat te verkrijgen. Bewaar het monster op ijs of bij vier graden Celsius tot u klaar bent om verder te gaan of voor maximaal 72 uur. Nu de bacteriën gereed zijn voor infectie, is het tijd om de fagen te ontdooien.

De max plaques Lambda Packaging wordt op ijs ontdooid. Gebruik één buis per ligatiereactie; het ontdooien duurt ongeveer 10 tot 15 minuten. Koel ondertussen een lege buis van 1,5 milliliter op ijs voor, gebruikend één buis per reactie.

Zodra de Lambda-verpakkingsextracten zijn ontdooid, brengt u onmiddellijk 25 µL van elk verpakkingsextract over naar een vooraf gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis en plaatst u deze op ijs. Bewaar het overgebleven verpakkingsextract bij -80 °C. Te lang ontdooid op ijs bewaren van de verpakkingsextracten zal de infectie-efficiëntie verminderen.

Voeg vervolgens 10 µL van de ligatiereactie toe aan elke 25 µL ontdooide extracten op ijs en meng door de oplossing meerdere keren te pipetteren zonder luchtbellen te introduceren. Centrifugeer kort om alle vloeistof onderin de buisjes te concentreren en incubeer de verpakkingsreacties gedurende 90 minuten in een waterbad van 30 °C. Ontdooi na 80 minuten incubatie de resterende verpakkingsextracten op ijs.

Nadat de verpakkingsreactie van 90 minuten is voltooid, voegt u de resterende 25 µL verpakkingsextract toe aan elke reactiebuis. Incubeer de reacties nog eens 90 minuten bij 30 °C. Voeg na de tweede incubatie 100 µL van de bereide fagenverdunningsbuffer toe aan elke verpakkingsbuis en meng voorzichtig; voeg vervolgens vijf µL chloroform toe aan elke buis.

U moet nu een totaalvolume van 165 µL in de buis hebben. Er kan een viskeus precipitaat ontstaan na toevoeging van chloroform. Vermijd dit precipitaat en de organische chloroform-fase bij het pipetteren van de fage-deeltjes.

Op dit punt kunnen de verpakte fage-deeltjes indien nodig enkele dagen bij vier graden worden bewaard, maar gebruik voor de beste resultaten vers bereide fagen. U kunt nu de gastcellen, die u tijdens de verpakkingsstappen van de fagen heeft gekweekt, infecteren met de verpakte fagen. Voeg de verpakte fagen toe aan EPI 300 T one resistente gastcellen met een OD 600 van 0,8 tot 1,0 in een verhouding van 400 µL EPI 300 T one resistente cellen voor elke 10 µL fage-deeltjes.

Om te voorkomen dat er chloroform vanaf de bodem van de buis met verpakte fagen wordt gepipetteerd, gebruiken we 125 µL van de verpakte fagepartikels en vijf mL voorbereide epi 300 T one resistente gastcellen; deze worden voorzichtig gemengd en vervolgens gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. De volgende stap is het bepalen van de titer van de verpakte fagen. Dit wordt gedaan door de geïnfecteerde bacteriën uit te platen op medium om de geïnfecteerde cellen te selecteren.

Tel vervolgens de resulterende kolonies en deel dit door het volume fage dat aan de bacteriën is toegevoegd die u heeft uitgeplaat. Het C one SMID bevat een chloramfenicolresistentiegen. Om geïnfecteerde klonen te selecteren, plaatst u de bacteriën uit op LB-platen die chloramfenicol bevatten.

Verdeel twee keer 50 µL en twee keer 10 µL van de faag-geïnfecteerde EPI 300 T one-resistente cellen over vier afzonderlijke platen en plaats de platen ondersteboven in een incubator bij 37 °C gedurende 16 tot 24 uur, maar niet langer dan 48 uur, totdat er kolonies zijn gevormd. Oogst ondertussen de resterende EPI 300 T one-resistente cellen uit de 5 mL infectie door centrifugatie bij 3.500 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant.

Voeg één milliliter LB met 20% glycerol toe aan de resus-buis. Resuspendeer de celpellet en verdeel deze in aliquoten van 100 microliters in cryovials van twee milliliter; vries direct in en bewaar bij minus 80 graden Celsius. Tel de volgende dag, ter voorbereiding op de colony picking-stap, het aantal klonen op de vier platen in de 37 graden Celsius incubator en bepaal de titer van de verpakte faag, die u in de volgende stap gebruikt.

De bevroren EPI 300 T one resistente glycerolstock bevat cellen die zijn getransduceerd met alle verschillende plasmiden in uw bibliotheek. Verspreid vervolgens een passende hoeveelheid op basis van de virale titer en de plaatgrootte van elke smid. Kloon op een vierkant van 2 45 bij 2 45 millimeter.

Bioassayplaten met LB en chlooramphenicol met gebruik van glaskralen. Voeg ook een kleine hoeveelheid LB-bouillon aan de plaat toe om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Houd er rekening mee dat het bereiden van de glycerolstock uw cellen bovendien ongeveer vijfvoudig concentreert.

Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C op de dagen van kolonie-picking en bereid 96- of 384-wellplaten voor, gevuld met 200 µL of 70 µL LB-bouillon per well. Voeg 12,5 µg chloramphenicol per ml bouillon toe voor antibioticaselectie en 10% glycerol voor het invriezen. Voor deze stap gebruiken we het geautomatiseerde qfi three plate filling-systeem.

De volgende stap is het overbrengen van kolonies van de voorbereide LB CHLORAMPHENICOL-platen naar de voorbereide 96- of 384-wellplaten voor invriezing. Voor deze stap gebruiken we de qix two clone-picking robot, volgens de gebruikershandleiding, om een steriele omgeving rond het gebied voor het plukken van klonen te creëren. Zet de UV-lamp 30 minuten aan; terwijl de UV-lamp aanstaat.

Bereid 500 milliliters van 1%bleach, 500 milliliters steriel gedeïoniseerd water en 500 milliliters van 80%ethanol voor. Wanneer het UV-licht uitgaat, vult u de trays van achteren naar voren zoals aangegeven. Vul de trays met 1%bleach, vervolgens met geautoclaveerd gedeïoniseerd water, en 80%ethanol in de voorste tray.

Zorg ervoor dat ze vol zijn, aangezien pluknaalden niet correct gewassen kunnen worden zonder voldoende wasoplossing. Nadat de parameters voor optimaal plukken zijn ingesteld, verwijdert u de deksels van uw bacteriële platen en uw met LB gevulde 96- of 384-wells platen en plaatst u deze tussen de steunen in de Q-picks. De platen in het werkgebied moeten strak tegen de rechtervoorhoek staan, zodat ze niet kunnen verschuiven tijdens het plukken.

Sluit vervolgens het voorpaneel. Zodra alle parameters zijn ingesteld, kan de pickprocedure beginnen. Wanneer alle picking is voltooid, spoel de borstels en trays af met gedeïoniseerd water en plaats ze op de bench om te drogen.

Ruim eventuele morsingen op die zijn ontstaan en veeg de binnenkant van de CICS af met 80% ethanol. Zorg ervoor dat alle glycerolstockplaten zijn gelabeld en plaats deze gedurende 24 uur in de incubator op 37 degrees Celsius om voor elke geplukte kolonie een cultuur te laten groeien. Laat een briefje op de incubator achter met daarop de datum, het aantal geïncubeerde platen, het tijdstip van incubatie, het tijdstip voor verwijdering en uw initialen.

Na de incubatie beschikt u over uw bibliotheek. Elke put bevat een cultuur van één bacteriële kloon waarin het PCC-one fo smid is geligeerd aan één fragment gescheurd DNA van uw startmonster. Vries de platen in bij -80 °C voor langdurige bewaring en feliciteer uzelf met een succesvolle uitvoering.

Het gepresenteerde protocol beschrijft de procedure voor het genereren van een omgevings-smid-bibliotheek om de genetische inhoud van een microbiële gemeenschap in een bepaald habitat vast te leggen. Dit protocol is bedoeld om een SMID-bibliotheek te creëren die representatief is voor de genetische inhoud van de bemonsterde omgeving, en moet de lezer in staat stellen om kritieke stappen te optimaliseren indien het aantal verkregen FO-smid-klonen aan het einde van de volledige procedure te laag is.

We hebben zojuist aangetoond hoe de FO SMID-bibliotheek kan worden geconstrueerd vanuit genomisch DNA afgeleid van een monster uit zeewater. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met genomisch DNA van hoge kwaliteit. Zorg dat al uw platen en reagentia gereed zijn voordat u begint en plan voldoende tijd in voor dit proces met meerdere stappen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.