Name: Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer een in vivo fluorescentiebeeldvormingsprotocol om spierregeneratie te monitoren met GFP-gelabelde myoblasten in muizen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in celtransplantatie en spierherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk van Z en Y Yang Wang werd mede mogelijk gemaakt door subsidie ​​van K02 AR051181 NIAMS / NIH, subsidies aan spierdystrofie Vereniging en Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Het werk van Q en X Zeng Xu worden ondersteund door een programma subsidie ​​toegekend aan de Optical Imaging Lab van het Brigham and Women&#39;s Hospital. De auteurs willen graag Wen Liu bedanken van de afdeling Anesthesie, BWH, voor technische hulp in cel te werken.

Celpreparaat <ol><li> Satelliet celisolatie <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Onder narcose zijn de spieren van de ledematen GFP transgene muizen (C57BL / Ka-βactin-EGFP) verwijderd. Na het snijden in kleine stukjes, satelliet-cellen zijn enzymatisch gedissocieerd door het incuberen van het gehakt weefsel met 2% dispase collagenase-oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Neutraliseer het enzym digestie met de groei media met Ham F-10 en 20% FBS, dissociëren de spier door herhaalde fijnwrijven met een Pasteur pipet. De cellen worden gefilterd door een zeef cel (Ø70-100 urn) en daarna uitgeplaat op een niet-gecoate schaal gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant en de plaat ze op een collageen gecoate schaal. Later herhaalt u deze stap 1 uur om de myoblasten te zuiveren. (Pre-plaat) </li><li> Wijzig de media en het bord van de cellen in de tijd. De laatste gezuiverde myoblasten worden gekweekt in medium met Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (groeimedium) bij 37 ° C met 5% CO2, 95% lucht. </li></ol> </li><li> Cultuur en uitbreiding van de primaire myoblasten in groeimedium met toevoeging van de fundamentele FGF van 10 ng / ml. </li><li> Voor alle in vivo experimenten, we injecteren 5x10 5 cellen per TA spier. </li><li> Bij het oogsten van de myoblasten, we los van de cellen met behulp van 0,25% trypsine / EDTA en wassen met PBS twee keer. De cel aantallen worden geteld met een hemocytometer en de cellen worden geresuspendeerd in HBSS met een concentratie van 5x10 4 cellen / ul. De geconcentreerde cellen in HBSS worden geplaatst op ijs en geïnjecteerd binnen 1 uur na de inzameling. </li></ol> In vivo beeldvorming <ol><li> Man mdx muizen op de leeftijd van 4-6 weken worden ingekocht bij Jackson laboratorium en gehandhaafd op een huisvesting van dieren faciliteit. </li><li> Na ongeveer een week van de accommodatie voor het milieu, de muizen zijn klaar om te worden geïmplanteerd met de gekweekte cellen. </li><li> Voor celtransplantatie, de muis wordt verdoofd door een intraperitoneale (ip) injectie van het mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Vervolgens het haar rond de TA spier gebied wordt verwijderd door het toepassen van Nair om het been en wacht 30 seconden te vegen het schoon met gedestilleerd water. </li><li> Terwijl de muis is nog steeds onder verdoving, zijn 5x10 5 cellen in 10μl HBSS langzaam geïnjecteerd in elk TA spier op 3 punten met behulp van een naald van 30 gauge. </li><li> Na stap 4, kan de muis regelmatig worden afgebeeld door de in vivo fluorescentie beeldvorming. De fluorescentie imaging station Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc), uitgerust met een zeer gevoelige CCD-camera, wordt gebruikt om beelden te verkrijgen van de hinderen benen van de muizen. </li><li> Op de dag van in vivo beeldvorming, hebben we eerst de haargroei op de TA spier. Indien nodig, we opnieuw toe te passen Nair om het haar te verwijderen zoals hierboven beschreven, na verlamming van de muis met het mengsel van ketamine en xylazine. </li><li> Terwijl de muis wordt onder narcose, plaatsen we de muis in een buikligging op een stuk zwart non-fluorescerend papier (zwart Artagain papier uit Strathmore). Om volledig de TA spier bloot te leggen voor een betere beeldvorming, we tape de achterpoten op het papier. </li><li> Plaatsen we de muis in de imaging-kamer en de positie van de achterbeen af ​​te beelden in het centrum van gezichtsveld van de camera. We hebben eerst naar de emissie-filter om een ​​traditionele grijs-schaal fotografisch beeld van het been met een belichtingstijd van 5 seconden duren. Stel de positie van de muis en de focus van de camera als dat nodig is. De imaging parameters inclusief belichtingstijd (1250 ms), monster hoogte (0,9 cm), enz., worden constant gehouden in de experimentele proces. </li><li> Vervolgens hebben we schakelaar in de juiste emissie-filter voor de groen fluorescerend eiwit golflengte. We nemen fluorescentie beeld met een belichtingstijd van 1250 ms en een binning aantal van 1. Na de beeldvorming, is de muis uit de beeldvorming kamer naar een kooi om het herstel te wachten. </li><li> Voor analyse, trekken we een region of interest (ROI) over de fluorescente signalen naar hun intensiteit te meten in termen van fotonen per seconde. We meten ook de grootte van de ROI in termen van aantal pixels als een andere kwantificering waarde. De imaging experimenten kunnen worden herhaald om de week of vaker over een paar maanden, indien nodig, longitudinale gegevens te verkrijgen. </li></ol> Aan het einde van de experimenten, wordt de muis gedood en de TA spier wordt geoogst voor histologie analyse.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

We zetten een betrouwbare en stabiele imaging platform voor het bijhouden van de fluorescentie gelabelde getransplanteerde cellen in het gastland skeletspieren in deze studie. GFP-gelabelde myoblasten van GFP transgene muis staat voor een soort van volwassen stamcellen die zullen worden kandidaten voor celtherapie in de toekomst. Een constante manipulatie zoals mobiele nummer, cel-injectie, heldere achtergrond, imaging positie en de machine parameter is van belang voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit beeld en in het bijzonder voor de kwantitatieve analyse. Fluorescentie beeldvorming heeft veel toepassingen in biomedisch onderzoek zoals het is non-invasief, eenvoudig te gebruiken, en heeft een hoge throughput. Daarnaast fluorescentie beeldvorming kan een kwantitatieve meting op basis van de foton telt, hoewel te wijten aan de verstrooiing, demping en absorptie, kan het licht niet door een grote afstand in het weefsel, dat is een tekortkoming van de techniek. Er zijn inspanningen gedaan om rood of nabij-infrarood reporter te gebruiken om de indringdiepte van het licht te verhogen. Een ander voordeel van fluorescentie beeldvorming is dat het vertaalbaar naar klinieken als de specifieke tl-reporter is goedgekeurd voor menselijk gebruik. In vergelijking met MRI, CT en PET, fluorescentie beeldvorming heeft een hoge flexibiliteit als het niet nodig dure hardware en imaging agenten. Een voorbeeld hiervan is het fluorescentie-based endoscoop en micro-endoscoop die zijn gebruikt in klinieken. Door het combineren van fluorescentie beeldvorming met andere modaliteiten, verwachten we de mogelijkheid om zowel de anatomische en functionele informatie over de onderliggende biologische processen te verwerven bereiken.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking dynamica van muscle innesteling in kleine dieren door in vivo tl-imaging

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Spierdystrofieën zijn een groep van degeneratieve spierziekten gekenmerkt door een progressief verlies van contractiele spiercellen. Op dit moment is er geen genezende behandeling beschikbaar is. Recente ontwikkelingen in stamcelbiologie hebben nieuwe hoop voor de ontwikkeling van effectieve cell-based therapieën voor deze ziekten te behandelen. Transplantatie van verschillende soorten stamcellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in de spieren van dystrofische diermodellen is in grote lijnen in het veld gebruikt. Een niet-invasieve techniek met de mogelijkheid om het getransplanteerde lot van de cel spoor lengterichting verder kunnen ons vermogen om de spieren innesteling te evalueren door getransplanteerde cellen meer nauwkeurig en efficiënt. In de huidige studie hebben we laten zien dat in vivo fluorescentie beeldvorming is een gevoelige en betrouwbare methode voor het bijhouden van getransplanteerde GFP (Green Fluorescent Protein)-gelabelde cellen in de muis skeletspieren. Ondanks de bezorgdheid over de achtergrond te wijten aan het gebruik van een extern licht nodig voor excitatie van fluorescerend eiwit, vonden we dat met behulp van hetzij naakt muis of het elimineren van haar met ontharing reagentia veel van dit probleem wordt geëlimineerd. Met behulp van een CCD camera, kan het fluorescerende signaal worden gedetecteerd in de tibialis anterior (TA) spier na injectie van 5 x 10 5 cellen van zowel GFP transgene muizen of eGFP getransduceerde myoblast cultuur. Voor meer oppervlakkige spieren, zoals de extensor digitorum longus (EDL), injectie van minder cellen produceert een detecteerbaar signaal. Intensiteit van het signaal kan worden gemeten en gekwantificeerd als het aantal uitgezonden fotonen per seconde in een regio van belang (ROI). Omdat de verkregen beelden tonen duidelijke grenzen afbakenen van het gebied geënt, kan de grootte van de ROI ook worden gemeten. Als de benen worden steeds geplaatst elke keer, de veranderingen in het totale aantal fotonen per seconde per spier en de grootte van de ROI weerspiegelen de veranderingen in het aantal geënt cellen en de grootte van het geënte gebied. Daarom zijn de veranderingen in dezelfde spier na verloop van tijd zijn kwantificeerbaar. In vivo fluorescentie beeldvormende techniek is voornamelijk gebruikt om de groei van cellen tumorogenic spoor, onze studie toont aan dat het een krachtig instrument dat ons in staat stelt om bij te houden over het lot van de getransplanteerde stamcellen.

Beschrijven we een<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescentie beeldvorming protocol om regeneratie van de spieren te controleren door GFP-gelabelde myoblasten na de transplantatie in de skeletspieren bij zowel gezonde en dystrofische muizen. Dit protocol kan worden aangepast aan de regeneratie van de spieren studie van transplantatie van andere typen cellen en in andere gespierd omstandigheden ook.

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Spierdystrofieën zijn een groep degeneratieve spierziekten die worden gekenmerkt door progressief verlies van contractiele spiercellen. Momenteel is er geen ...

Hallo, ik ben Juwan Ma van de afdeling anesthesie van het Bergham Women's Hospital in Boston. Vandaag laten we u een techniek zien voor het verkrijgen van in vivo fluorescentiebeelden om de voortgang van spierregeneratie bij muizen te monitoren. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de innesteling van getransplanteerde spierstamcellen te bestuderen.Laten we beginnen. GFP-gelabelde cellen voor transplantatie worden geïsoleerd en gekweekt uit GFP-transgene muizen. Voordat we verdergaan, wordt met een knijpje in de teen bevestigd dat de muis volledig is geanestheseerd. Vervolgens worden de spieren van het achterbeen verwijderd. Onder aseptische omstandigheden wordt de spier daarna gemacererd.Satellietcellen worden gedissocieerd door het fijngehakte weefsel gedurende één uur bij 37 °C te incuberen in een 2% collagenase-oplossing. Na de incubatie wordt groeimedium bestaande uit Ham F 10 en 20% FBS toegevoegd om de enzymatische digestie te stoppen. De spieren worden vervolgens gedissocieerd door herhaaldelijk tritureren met een Pasteurpipet.Vervolgens worden de cellen door een celzeef gefilterd en vervolgens geplaatst op een ongecoate kweekschaal. De schaal wordt gedurende één uur in een standaard celkweekincubator geplaatst. Om satellietcellen te scheiden van andere celpopulaties met sterkere adhesie-eigenschappen, wordt het supernatant overgegoten op een collageen-gecoate schaal en nogmaals een uur geïncubeerd.Na deze incubatie wordt het resulterende, met satellietcellen verrijkte supernatant opnieuw verwijderd en aangebracht op een nieuwe collCen-gecoate plaat en gekweekt tot er myoblastkolonies worden waargenomen. Dit proces wordt prepl genoemd; cellen worden gepasseerd zodra een cellulaire confluentie van 60 tot 70% is bereikt. Een klein deel van de cellen wordt gebruikt voor immunocytochemie, waarbij kleuring met myogene celmarkers wordt toegepast om de zuiverheid van de spiercellen in de cultuur te verifiëren.Zodra de zuiverheid van de myogene cellen is bevestigd, worden de cellen in dezelfde cultuur uitgebreid. Voor de transplantatieomstandigheden voorafgaand aan de celtransplantatie worden de cellen losgemaakt met 0,25% Trypsin-EDTA. De cellen worden twee keer gewassen en resuspendeerd in HBSS op een concentratie van vijf keer 10⁷ cellen per milliliter; er worden 10 µL van de celoplossing per musculus tibialis anterior, of TA-spier, geïnjecteerd.Voor in vivo beeldvorming worden eerst met GFP gelabelde myoblasten getransplanteerd in mannelijke muizen van vier tot zes weken oud. De muis wordt geanestheseerd met ketamine-xylazine, en de procedure wordt gestart nadat de anesthetische status is bevestigd. Om achtergrondruis te verminderen, worden de haren op beide achterpoten verwijderd door Nair op de poten aan te brengen en 30 seconden te wachten voordat dit wordt afgeveegd.Gebruik een nieuwe wattenstaafje gedrenkt in gedestilleerd water om de poten opnieuw af te vegen, zodat resterende resten en haren worden verwijderd voordat de cellen in de muis worden getransplanteerd. Zuig eerst vijf keer 10⁵ cellen in 10 µL HBSS op in een Hamilton-spuit. Injecteer met een naald van gauge 30 een gelijk aantal cellen in drie posities langs de lange as van de TA-spier: het bovenste mediale deel en het onderste deel.Houd na elke injectie de naald twee minuten vast voordat u deze uit de spier trekt om lekkage langs de naald te voorkomen. Trek tijdens de wachttijd dezelfde hoeveelheid cellen in een andere spuit en injecteer de contralaterale TA-spier. Na de celinjecties wordt de muis onmiddellijk in buikligging op een stuk zwart, niet-fluorescerend papier geplaatst, waarbij beide poten met de voetzool naar beneden aan het papier worden vastgezet en de poten 90 graden gespreid worden. De muis wordt vervolgens in de kamer van een Night Owl LB 981 fluorescentie-beeldstation geplaatst.Met behulp van een zeer gevoelige CCD-camera wordt één achterpoot in het midden van het gezichtsveld van de camera geplaatst. Maak eerst een traditionele grijswaardenfoto van de poot. Om te beginnen met de beeldvorming wordt een passend emissiefilter met een specifieke golflengte voor groen fluorescerend proteïne gekozen.Maak één afbeelding met een belichtingstijd van 1.250 milliseconden, gevolgd door een afbeelding met een belichtingstijd van 500 milliseconden. We stellen vast dat een langere belichtingstijd de detectie van een zwak signaal mogelijk maakt, terwijl een kortere belichting meer details onthult. Nadat één achterpoot is gefotografeerd, positioneert u de andere achterpoot in het midden van het gezichtsveld van de camera en beeldt u deze poot op dezelfde wijze af als eerder getoond.Om vergelijkbare resultaten te garanderen, moet de hoogte van het specimen ongewijzigd blijven. Na de beeldvorming wordt de muis teruggeplaatst in een kooi en wordt het herstel van de anesthesie gemonitord. Voor de analyse wordt een region of interest over de fluorescentiesignalen getekend om het aantal fotonen per seconde te meten.We meten ook de grootte van het interessegebied in aantal pixels voor een extra kwantitatieve waarde om longitudinale gegevens te verkrijgen; de beeldvormingsexperimenten kunnen naar behoefte op verschillende dagen of weken worden herhaald. Voor de experimenten vertoonde een fluorescentiebeeld van een achterpoot van de muis, gemaakt op de dag dat de GFP-gelabelde cellen werden geïnjecteerd, een hoge signaalintensiteit. De signaalintensiteit daalde vervolgens op dag twee en steeg daarna naar een stabiel niveau op dag 7, 14 en 21. Wanneer deze veranderingen in fluorescentie werden gekwantificeerd door de signaalintensiteit te meten als fotonen per seconde, observeerden we een duidelijke afname van de signaalintensiteit één dag na de injectie, wat wijst op een afname van het aantal GFP-positieve cellen.Tegen dag zeven, 14 en 21 was de signaalintensiteit echter toegenomen tot een stabiel niveau, wat erop wees dat er spierregeneratie had plaatsgevonden. We hebben zojuist laten zien hoe in vivo fluorescentie-imaging kan worden gebruikt om de voortgang van regenererende spieren te monitoren na de injectie van GFP-gelabelde cellen. Met deze methode kunnen we de dynamiek van spierregeneratie bestuderen na de injectie van allerlei soorten fluorescent gelabelde cellen.Aangezien beelden non-invasief op vastgestelde intervallen kunnen worden verkregen, kunnen nauwkeurigere longitudinale gegevens worden verzameld met minder dieren en een lagere werkdruk. Bij het gebruik van vaste meetparameters zouden beelden van dezelfde dieren over een bepaalde periode kwantitatief vergelijkbaar moeten zijn. Om de achtergrondruis te verminderen, is het uiterst belangrijk om een schoon huidoppervlak boven de spier te behouden; het is daarom absoluut essentieel om al het haar op de poten te verwijderen en het gebied grondig af te vegen met wattenstaafjes of wattenpads.En onthoud dat u telkens dezelfde set parameters moet gebruiken om de consistentie tussen al uw metingen te waarborgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

This video demonstrates the protocol for implanting green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells orthotopically into the pancreas of the mouse. The orthotopic mouse model helps in investigating the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

Fluorescent Orthotopic Mouse Model: Implanting GFP Expressing Cancer Cells into Mouse for Assessing Tumor Progression In Vivo

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van...

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op...

Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Dit artikel beschrijft hoe in vivo (met behulp van oppervlakte- en naaldelektrodearrays) en ex vivo (met behulp van een diëlektrische cel) elektrische impedantiemyografie op de gastrocnemiusspier van knaagdieren kan worden uitgevoerd. Het zal de techniek demonstreren bij zowel muizen als ratten en de beschikbare modificaties (d.w.z. zwaarlijvige dieren, pups) beschrijven.

In vivo en ex vivo elektrische impedantiemyografie uitvoeren bij knaagdieren

Leer een in vivo fluorescentiebeeldvormingsprotocol om spierregeneratie te monitoren met GFP-gelabelde myoblasten in muizen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in celtransplantatie en spierherstel.

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Meer video's verkennen