Antifouling zelf-geassembleerde monolagen op micro-elektroden voor Patterning Biomoleculen

Deze procedure begint met het vervaardigen van een micro-elektrode op een siliconensubstraat. Een zelfgeorganiseerde monolaag van polyethyleenglycol wordt gevormd over de micro-elektrode en het substraat om vervuiling door microtubuli te voorkomen. Vervolgens worden rumine-gelabelde microtubuli geprepareerd.

Ten slotte worden microtubuli met behulp van elektroforese in een patroon op de gepatte elektroden aangebracht. Hallo, ik ben John Noel van het Nana Lab van de afdeling Natuurkunde en van het Molecular Biomechanics Laboratory van de afdeling Biomedische Techniek aan de Texas A&M University. Ik ben Wilfree Teza van de afdeling Natuurkunde en directeur van het Center Skill Science and Technology aan de Texas A&M University.

Ik ben Juan Quang, directeur van het Molecular Biomechanics Laboratory van de afdeling Biomedical Engineering aan de Texas A&M University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het vervaardigen van micro-elektroden die zijn gecoat met een non-fouling zelfgeassembleerde monolaag. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om microbuisjes te bestuderen met behulp van elektroforese.

Laten we beginnen. Gebruik eerst een kraspen of wafer-snijder om siliciumwafers in stukjes van 1 centimeter bij 1,5 centimeter te snijden om als substraten te gebruiken. Reinig nu de substraten door ze in een bekerglas te plaatsen met voldoende aceton om ze volledig te bedekken en soniceren gedurende vijf minuten, zonder dat de substraten mogen opdrogen.

Spoel ze met vers aceton en spoel ze vervolgens onmiddellijk opnieuw met isopropanol en gebruik stikstof om ze te drogen. Fabriceer de gouden micro-elektroden op de schone substraten met behulp van standaard positieve toon fotolithografie of elektronenstraallithografie. Houd bij het ontwerpen van de patroongeometrie de diameter van elk elektrodepatroon onder de 100 microns. Om dekking door de polyethyleenglycoltrimethoxysilaan zelfgeassembleerde monolaag of peg Sam te garanderen, moeten contactpads worden toegevoegd die zich op 300 tot 500 micrometers van het patroon bevinden, met een lijn van één millimeter die de pad met de elektrode verbindt.

Nadat het patroon in de resistlaag is ontwikkeld, wordt met een pincet een lijn in de resist gekrast van het contactpad naar de rand van het substraat. Bij de metaaldepositie maakt deze kras een elektrisch contact tussen de elektrode en de rand van het substraat mogelijk. Voor het depositeren van de metaallaag wordt een depositiekamer gebruikt, bij voorkeur met twee bronnen.

De elektroden worden gevormd door de depositie van twee nanometer chroom, gevolgd door zes nanometer goud. Zonder het vacuüm te verbreken, kan een kwartskristalmicrobalans in de kamer worden gebruikt om de dikte van de films tijdens de depositie te meten. We kunnen nu beginnen met het prepareren van de zelfgeassembleerde monolaag in een goed geventileerde ruimte; verwarm een oven voor tot 75 °C. Bereid de functionaliseringsoplossing door één milliliter peg-silaan toe te voegen aan 20 milliliter tolueen in een glazen bekerglas van 250 milliliter.

Meng goed door vijf tot 10 keer op en neer te pipetteren en vervolgens 30 seconden met de pipet te roeren. Plaats de patroonmonsters met de patroonzijde naar boven in het bekerglas, waarbij u ervoor zorgt dat ze volledig ondergedompeld zijn in de oplossing en gelijkmatig over de bodem van het bekerglas zijn verdeeld. Plaats het bekerglas in de oven en bak het 18 tot 21 uur terwijl de Sam wordt gevormd.

Bereid de tegenelektrode voor door één nanometer chroom gevolgd door vier nanometers goud af te zetten op een glazen dekglas van 22 bij 50 millimeter. De tegenelektrode moet bijna transparant zijn met een lichtgrijze of roze tint. Bewaar de tegenelektrode met de gecoate zijde naar boven in een petrischaal om deze schoon te houden.

Haal na 18 tot 21 uur het bekerglas uit de oven. Het tolueen zou moeten zijn verdampt, waardoor de patroonmonsters achterblijven in een viskeus peg cline-residu. Voeg 20 milliliters tolueen toe aan het bekerglas en laat de monsters één tot twee minuten weken.

Verwijder de monsters uit het bekerglas en spoel ze eerst met tolueen, daarna met isopropanol en droog ze tot slot met stikstof. Op dit punt moeten de monsters er schoon uitzien en moet de Sam-laag met het blote oog onzichtbaar zijn. Op deze manier geprepareerde Sam's zijn tot twee dagen bruikbaar wanneer ze worden bewaard onder koele en droge omstandigheden.

Een mislukte vorming van SAM resulteert in een troebele of ongelijkmatig gekleurde residulaag op het oppervlak. Nu de SAM's zijn geprepareerd, kunnen we beginnen met de polymerisatie van tubuline tot microtubuli. Begin met het ontdooien van ongelabelde tubuline en r domine tubuline, en combineer deze onmiddellijk in een verhouding van twee op één ongelabeld ten opzichte van gelabeld om heldere microtubuli te verkrijgen.

Meng deze goed door meerdere keren met de pipet op en neer te zuigen. Polymeriseer vervolgens de tubuline gedurende 20 tot 40 minuten in een verwarmd waterbad op 37 °C. Bereid een Taxol-buffer voor door 20 µM Taxol te mengen met de buffer.

Meng goed door meerdere keren te pipetteren en te vortexen, en plaats de buis vervolgens in het verwarmde bad bij 37 °C. Verdun na polymerisatie de microtubuli in warme Taxol-buffer voor pipetteren en bescherm ze tegen licht. Verifieer of de polymerisatie van de microtubuli succesvol was en of de microtubuli stabiel blijven onder meerdere minuten fluorescentie-excitatie.

Beeld de geprepareerde microtubuli af met een zuurstofvangersmengsel zodra de polymerisatie van tubuline tot microtubuli voltooid is. Laten we beginnen met het patroonvormen van de MTS met elektroforese. Begin met het snijden van een stuk dubbelzijdige tape in dunne stroken door het op een glazen objectglas te plaatsen en een scheermesje te gebruiken om te snijden; plaats twee stroken dubbelzijdige tape over het met Sam gecoate monster met het patroon, zodanig dat de elektrode tussen de stroken ligt en het verbindingspad loodrecht op de tape loopt.

Plaats de tegenelektrode op de dubbelzijdige tape, waarbij de metalen zijde de tape raakt en de rand van het monster ongeveer drie millimeter over de tegenelektrode steekt. Knip verschillende stukken geïsoleerd koperen magneetdraad van 15 centimeter en strip aan beide uiteinden één centimeter van de isolatie. Gebruik een kleine druppel zilververf om een draad te bevestigen aan het blootgestelde gouden oppervlak van het substraat, waarbij u er nauwgezet op let dat er geen elektrisch contact met de tegenelektrode wordt gemaakt.

Gebruik nu zilververf om een tweede draad aan de tegenelektrode te bevestigen. Elektrodedraden die met zilververf zijn bevestigd, kunnen met tape verder aan de monsters worden vastgezet. Voeg vervolgens met een pipet microtubuli toe in de gewenste verdunning, bekijk het beeld bij een 20-voudige vergroting en lokaliseer het patroon op de siliciumwafer voordat er een spanning wordt aangelegd.

Vanwege de diepte van de stroomkamer kunnen objectieven met een grote werkafstand nodig zijn om het bovenoppervlak van de stroomkamer te beelden. De afstand van het monsteroppervlak tot het bovenoppervlak van de stroomkamer wordt bepaald door de dikte van de tape en ligt doorgaans rond de 60 tot 100 micrometers. Breng een spanning van maximaal één volt aan en observeer de migratie van microtubuli.

Indien omkeerbare vangst van microtubuli gewenst is, kan nagellak worden gebruikt om de stroomkamer af te dichten om laterale drift te voorkomen, waarbij lagere spanningen tot ongeveer 0,5 volt worden toegepast. Migratie kan worden gevolgd door het verticale brandvlak van de microscoop aan te passen; bij aangelegde spanningen van ongeveer 0,9 tot 1,2 volt lokaliseren de microtubuli zich op de elektrodeoppervlakken.

Een hoger voltage zorgt voor een snellere migratie en een sterkere adhesie, maar een excessief voltage zal elektrolyse induceren en depolymerisatie veroorzaken. Microtubuli: we hebben zojuist gedemonstreerd hoe u SAM-gecoate micro-elektroden voor MT-patronering voorbereidt, omdat de SAM-coating de absorptie van microtubuli op de micro-elektroden voorkomt. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor reversibele patronering van microtubuli.

Bovendien is dit proces niet alleen beperkt tot microtubuli, maar kan het ook worden gebruikt om biomoleculen in het algemeen te patroneren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.